使用分散固相萃取产品进行高通量抗体纯化的方法

抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白，在人体免疫系统中发挥着极其重要的作用，已广泛应用在医药健康、环境监测及食品安全等领域。目前抗体纯化的最常用手段是亲和纯化法，但该方法的常规操作是个耗时的过程。由于技术所限，国内及国际大多数生物药企业在初期筛选过程中还是使用商用纯化试剂盒，利用重力柱法（包括 FPLC 联用分离柱）、磁珠法（Magnetic Beads）或离心萃取法（Spin Column）手动提纯抗体，效率极低。虽已有可进行高通量筛选的产品，但其抗体提纯容量偏低，且数据平行性差，所以不适合抗体的提纯及平行筛选。尽管有些技术试图将其抗体的亲和分析柱和各种自动化的移液操作平台相结合，但是还是无法解决在高通量抗体分离时容量小、回收率低、及平行性差等缺陷，无法真正推广应用在实际研发过程中。

下面介绍一种利用枪头式分散固相萃取产品（MicroSep^® Protein A/G tips）进行抗体纯化的高通量自动化方法，该方法通过将松散的湿性填料与特制枪头式分散移液管相结合，构成枪头式分散固相微萃取柱，通过从枪头式分散固相微萃取柱底端吸入的方式，并可与自动移液工作站相结合，达到快速纯化目标抗体的目的。

图 1 MicroSep^® Protein A/G tips 结构图

MicroSep^® Protein A/G tips 利用分散固相萃取专利技术来富集对 Protein A/G 具有亲和力的目标分析物。分散技术有助于增强树脂与目标分析物结合，从而缩短孵育时间、简化处理过程。使用 MicroSep^® Protein A/G tips 通过简单的移液操作——吸液/分液即可完成对目标分析物的提取，结果一致性好、回收率高。

MicroSep^® Protein A/G tips 产品可与 Hamilton 、Integra 移液工作站配套使用。我们为用户提供自动纯化的应用程序包，并支持用户自定义工作流程。

图 2 Hamilton 自动移液工作站

图 3 Integra 自动移液工作站

抗体纯化过程：

(1) 样品处理：将 CHO 细胞培养液或其他培养物离心，上清液（0.5 mL – 2 mL/每孔）作为样品溶液用于步骤 (3)；

(2) 预处理：取出 1 ～ 96 支 1 mL MicroSep^® Protein A/G tips 枪头式分散固相微萃取柱，除去上下保护帽体，与 Hamilton 或 Integra 自动移液器紧密结合后，吸入 600 µL pH 7.4 1× PBS，吸液过程中使微萃取柱中 Protein A/G 树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打 3 次，最后排空弃掉 1× PBS；

图 4 MicroSep^® Protein A/G tips 纯化流程

(3) 抗体吸附：用步骤 (2) 中预处理后的萃取柱吸入步骤 (1) 中准备的样品，一次吸入体积 800 µL，吸液过程中使微萃取柱中 Protein A/G 树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打 20 - 40 次，最后排空；

(4) 洗涤 1：继续吸入 600 µL pH 7.4 1× PBS 结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中 Protein A/G 树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打 3 次，最后排空弃掉结合缓冲液；

(5) 洗涤 2：继续吸入 600 µL pH 7.4 1× PBS，吸液过程中使微萃取柱中 Protein A/G 树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打 3 次，最后排空弃掉 1× PBS；

(6) 抗体洗脱 1：吸入 200 µL pH 3.5 0.1 M 柠檬酸钠溶液，吸液过程中使微萃取柱中 Protein A/G 树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打 3 次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的抗体溶液；

(7) 抗体洗脱 2：上述微萃取柱中吸入 200 µL pH 3.5 0.1 M 柠檬酸钠，吸液过程中使微萃取柱中 Protein A/G 树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打 3 次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的抗体溶液；

(8) 中和、脱盐：在上述纯化过的抗体溶液中加入 50 µL 1 M Tris buffer。也可根据下游实验选择 MicroSep^® Size X tips 产品进行高通量自动化脱盐。

推荐方案 1：利用 Hamilton Microlab 自动移液工作站及 1 mL / 300 µl MicroSep^® Protein A/G tips 枪头式分散固相微萃取柱对单克隆抗体的纯化。

Microlab^® STAR 系列工作站是以液体处理为核心的生物医药实验室自动化操作平台的巅峰之作，拥有多项世界领先水平的专利技术，也是用户定制型自动化实验操作平台，可进行自动的加样、试剂分配、超微量移液，以及与液体处理相关的振荡、孵育等操作。如果整合第三方设备，可将整个实验流程实现全自动化。

Microlab^® NIMBUS 是紧凑而灵活的小型自动化移液系统，它基于 Hamilton 优良的工作站传统，适用于小通量的应用。NIMBUS 高效率的台面设置提高了最快的速度、最高的吸头定位精度以及移液准确性。

图 5 Hamilton 结合 1 mL MicroSep^® Protein A/G tips 用户控制面板

优点：功能强大，高通量、实验流程全自动，结合 MicroSep^® Protein A/G tips 可完美解决医药研发等检测、分析、科研领域的各种抗体分离、提纯问题。

缺点：程序编制较复杂 (可向 MicroSep 公司索取带用户界面的基础应用程序包，用户可以直接使用，也可根据需求进行修改）

推荐方案 2：利用 Integra Assist/Assist Plus 自动移液工作站及 1250 µL MicroSep^® Protein A/G tips 枪头式分散固相微萃取柱对单克隆抗体的纯化。

Integra Assist 可一次处理 1～12 个样品（Assist Plus 可适配可调间距移液枪），界面简单，可通过简单的操作将所需净化处理过程存储为程序方便重复使用。

图 6 Integra 结合 1250 µL MicroSep^® Protein A/G tips 纯化流程

优点：价格便宜，操作简便

缺点：处理样品相对较少；板位较少，可能需要人工加各步所需缓冲液

图片来源：微色谱