独体—基于纤连蛋白类型Ⅲ结构域框架的抗体模拟 Akiko Koide and Shohei Koide
丁香园
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1. 介绍
蛋白质工程的一个主要目的是生产能够与特定靶分子结合的新的生物分子。这样的分子会应用于生物技术的许多领域，包括诊断、治疗和催化。虽然存在大量的天然蛋白，可供这些应用和开发，但用工程手段制造新的、有用的生物分子的办法仍是有吸引力的。 因为，它不受天然生物分子可用性的限制。抗体的基本构架中可变的链套呈现在基本不变的框架上，以及抗体工程的成功启发了一些研究组去发展“分子框架”[ 1，2] 。这些努力的主要目标一直是在保留呈递多重肽片段以与靶分子结合的能力的同时，克服抗体和抗体片段的缺点，包括大尺寸、杂二聚特性（除单免疫球蛋白结构域外)、低构象稳定性和难于大规模生产。至今已发展出来的，这样的人工分子都是基于免疫球蛋白片段或者小单体蛋白。
我们发展了以纤连蛋白 Ⅲ 型结构域（FN3 ) 为分子框架的应用。纤连蛋白是一个大蛋白，在胞外基质生成和细胞间相互作用中起基本的作用。它由多次重复的 3 类（、Ⅱ 和 Ⅲ ) 小结构域组成 [3]。FN3 是广泛存在的结构域，在所有动物蛋白中，其出现率估计为 2% [4]。在人纤连蛋白中，有 15 个 FN3 的重复单位。我们的系统建立在 FNfn10 之上。FNfn10 是小的（94 个残基 ）单体，且不含二硫键。正确折叠的 FNfn10 在细菌中的高表达是很容易的 [5]。FNfn10 的三维结构 [ 6，7] 最好描述为 β 三明治，类似于抗体重链结构域的易变结构域，只是 FNfn10 有 7 条 β 链，而不是 9 条（ 图 6.1)。FNfn10 在其两端各含 3 条表面链套，具有载呈多重肽片段的能力。FNfn10 的这些特性使其成为分子框架的理想候选者。
我们证明了通过筛选离散化表面链套残基的 FNfn10 组合库，可以设计制造出新结合蛋白（称为独体），得到的独体，保留框架蛋白的整体结构和良好的构象稳定性 [8]。此外，因为 FNfn10 不需要二硫键来协助恰当的折叠和维持稳定性，所以独体兼容于任何筛选方法，包括噬菌体展示 [8]，肽-核糖核酸融合 [9] 和体内方法，如酵母双杂交系统 [ 10 ]。我们还证明了独体可以很容易地用于细胞内 [10] 。
我们在本章描述构建组合库、用噬菌体展示和酵母双杂交技术筛选蛋白库和用细菌生产独体的方法。
2. 材料
2.1 培养基
( 1 ) Luria-Bertani ( LB )：每升水加 10 g 菌用胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物和 10 g 氯化钠，pH 7.0。用平板时，加 15 g/L 菌用琼脂糖。
( 2 ) SOC：将 20 g 胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物和 0.5 g 氯化钠溶于约 900 ml 水中；加入 10 ml 250 mmol/L 氯化钾和 5 ml 2 mol/L 氯化镁；并将最终体积调至 1 L。高压灭菌、冷却，并加入 20ml 1 mol/L 葡萄糖，用 0.2 μm 滤膜过滤除菌。
( 3 ) 2 x YT：每升水加入 16 g 菌用胰蛋白胨、10 g 酵母抽提物，pH 7.0。
( 4 ) Superbroth ( 超级肉汤）：每升水加入 12 g 菌用胰蛋白胨、24 g 酵母抽提物和 5 g 甘油。高压灭菌后加 50 ml 含有 0.17 mol/L 磷酸二氢钾和 0.72 mol/L 磷酸氢二钾的灭菌溶液。
( 5 ) M9-胰蛋白胨：将 6.4 g 7 水合磷酸氢二钠、1.5 g 磷酸二氢钾、0.25 g 氯化钠、0.5 g 氯化铵和 5 g 菌用胰蛋白胨在 500 ml 水中混合，灭菌。冷却至 50°C，并加入 5 ml 50% 葡萄糖、1 ml 1 mol/L 硫酸镁和 50 μl 1 mol/L 氯化钙。
( 6 ) 抗生素最终浓度：100 μg/ml 氨苄青霉素（Ap)；30 μg/ml 氯霉素和 10 μg/ml 四环素（Tc )。
( 7 ) 基本硫酸卡那霉素（Km ) 板：将 6 g 菌用琼脂糖混入 320 ml 水中并灭菌，然后冷却至 50°C。在另外一瓶中加入 4.2 g 磷酸氢二钾、1.8 g 磷酸二氢钾、0.4 g 硫酸铵、0.2 g 柠檬酸钠和 64 ml 水，灭菌后冷却至 50°C。加入 64 ml 培养基到这个瓶中，4 ml 10 mg/ml 尿嘧啶、1.6 ml 50% 葡萄糖、0.32 ml 1 mol/L 硫酸镁、0.66 ml 30 mg/ml Km 和 20 μl 100 mg/ml 硫胺。
( 8 ) 酵母抽提物-蛋白胨-葡萄糖（YPD)：20 g 蛋白胨、10 g 酵母抽提物和 20 g 葡萄糖溶于 1 L 水中。用平板时，加入 20 g/L 菌用琼脂糖。
( 9 ) 酵母全价（YC) 葡萄糖 leu- his- trp - ura - : 为得到 1 L 试剂，混合 1.2 g 的无氨基酸无硫酸铵酵母氮源（Difco) ，5 g 硫酸铵、10 g 琥珀酸、6 g 氢氧化钠、0.6 g 全价补充混合物- leu- his- trp - ura- (Q- BIOgene)、0.1 g 半胱氨酸和 960 ml 水，并灭菌。加入 40 ml 灭菌的 50% 葡萄糖并彻底混合。用平板时，加入 20 g/L 菌用琼脂糖。
( 10 ) YC Glc his-ura-trp-：灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸到 YC Glc leu - his- trp - ura- 培养基中。
( 11 ) YC Glc trp -：灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸、0.05 g 组氨酸和 0.1 g 尿嘧啶到 YC Glc leu- his- trp - ura- 培养基中。
( 12 ) YC Glc his - ura- : 灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸到 YC Glc leu - his- trp - ura - 培养基中，并用 910 ml 水而不是 960 ml 水。灭菌后，加入 50 ml 灭菌的 2 mg/ml 色氨酸溶液。
( 13 ) YC 半乳糖蜜三糖 leu- his- trp - ura-：在 YC Glc leu- his- trp- ura- 培养基中用 100 ml 灭菌 20% 半乳糖和 50 ml 灭菌 20% 蜜三糖代替葡萄糖。用 850 ml 水而不是 960 ml。
( 14 ) YC Gal Raf his- trp - ura-：灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸到 YC Gal Raf leu- his-trp- ura- 培养基中。
2.2 试剂
( 1 ) 聚乙二醇（PEG) /氯化钠溶液：混合 66.6 g PEG 8000，78 g 氯化钠和 317 ml 水并灭菌。
( 2 ) HEPES 缓冲液：1 mmol/L HEPES，pH 7.0 (HEPES：N2-羟乙基哌嗪-N'-乙烷-硫酸）。
( 3 ) 涂布溶液：20 μg/ml 配体溶于 0.1 mol/L 碳酸氢钠，pH 8.6。
( 4 ) Tris 缓冲盐水（TBS )：50 mmol/L Tris - 氯化氢和 150 mmol/L 氯化钠，pH 7.5。
( 5 ) TBS-Tween-20 ( TBST): TBS 和 0.5% ( V/V ) Tween-20。
( 6 ) 5% 灭菌牛血清蛋白（BSA) : 过滤除菌的 BSA 于水中并储藏在 4°C。
( 7 ) TBST- BSA: TBST 加入 1 mg/ml BSA。
( 8 ) 酸性洗脱缓冲液：0.1 mol 氯化氢，加入甘氨酸和 1 mg/ml BSA，酸碱度调至 pH 2.2。
( 9 ) 2 mol/L Tris-碱。
( 10 ) 琼脂糖-磷酸溶液：每板混合 8 ml 水、2 ml 0.5 mol/L 磷酸钾缓冲液，pH 7.0，0.07 g 琼脂糖（根据平板的数量，加倍用量）。
( 11 ) 2 X β-半乳糖苷酶检验溶液：120 mmol/L 磷酸氢二钠、80 mmol/L 磷酸二氢钠、20 mmol/L 氯化钾、2 mmol/L 硫酸镁、0.54% β-巯基乙醇、0.0008% 十二烷基硫酸钠、8 mg/ml 2-硝基苯-β-D-半乳糖苷，pH 7.0。等分为小份存储于 -20°C。
( 12 ) 缓冲液 B : 20 mmol/L Tris - 氯化氢，pH 8.0，500 mmol/L 氯化钠。
( 13 ) 缓冲液 C : 20 mmol/L Tris- 氯化氢 ，pH 8.0，500 mmol/L 氯化钠和 500 mmol/L 咪唑。
( 14 ) 缓冲液 D : 50 mmol/L 磷酸钠和 500 mmol/L 氯化钠，pH 8.0。
( 15 ) Tris-氯化氢-EDTA (TE) 缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢和 1 mmol/L EDTA，pH 8.0。
( 16 ) 50 X Tris-乙酸盐- EDTA 缓冲液：溶解 242 g Tris-碱、57.1 ml 冰乙酸和 18.6 g EDTA 于重蒸水中至终体积 1 L。调节 pH 至 8.3。
( 17 ) 大肠杆菌菌株：CJ236 (Bio- Rad) 、KC8 (Origene)、XL-1 Blue (Stratagene) 和 SS-320 ( 见参考文献 [ 11 ] ; 注 1)。
( 18 ) 酵母菌株：EGY48 和 RFY206 ( Origene；参考文献 [ 12 ] 和 [ 13 ])。
2.3 载体
( 1 ) pAS38 : 融合于 M13 基因 III 的 C 端结构域的编码 FNfn10 的 pBluescript SK ( + ) 噬粒（ Stratagene) 的衍生物。我们用大肠杆菌偏好密码子构建了 FNfn10 基因 [8] 。这是为了独体的单价展示。此载体的 PvuⅡ 片段在与 pBluescriptSK ( + ) 的相反方向。
( 2 ) pAS45：从 pET15b (Novagen) 衍生的独体表达质粒。它表达带有 His 标签的独体融合蛋白。独体基因含有一个 Arg 6 到 Thr 的突变，为了消除凝血酶的一个酶切位点，从一开始就已引入 [8]。
( 3 ) pAS47: 在 FG-链套区含有一终止密码子的 PAS38 的衍生物（图 6.1A )。这是为了在构建 FG-链套区残基离散化的实物库时用作突变模板。
( 4 ) JCFN : 编码独体 -基因 V III 融合蛋白的 JC- M13-88M 的衍生物。这是为独体多价展示用的 M13 噬菌体体系。
( 5 ) pYT45 : 编码 B42 (激活蛋白）- 独体融合蛋白的 pYesTrp2 (Invitrogen ) 的衍生物 [10，15 ] 。这是用来构建酵母双杂交筛选用的独体库（见注 2 )。
( 6 ) PSH18-34：酵母双杂交筛选用的 LacZ 报告质粒（Origine) 。
( 7 ) pEG202：酵母双杂交筛选用的 LexA-诱饵质粒（Origine；见注 2 )。
独体质粒和实物库可从通信作者处得到。
4. 注
1. SS-320 不是商品，但按照 Sidhu 等的操作工艺很容易合成。
2. 我们选择 pYeSTrp2 作为捕食质粒（相对于诱饵而言-译者），主要是因为在这一质粒中存在允许 Kunkel 突变的 f1 起点。我们选择 pEG202 为诱饵质粒，因为该质粒在酵母中的维护较易，且较 pHybLex (Invitrogen ) 经济，后者需要 zeocin 抗生素。
3. 寡核苷酸的电洗脱。在一端用管夹封闭的透析管（MWCO 3500，18 mm 宽）中，加入凝胶片和 1.8 ml TE 缓冲液，然后在清除气泡后，用另一管夹封闭开口。将凝胶片放在透析管的一边，并淹没整个装置于一装满 1 X Tris-乙酸盐- EDTA 缓冲液的凝胶盒中。用 200 V 电压，电洗脱寡核苷酸 10 min。从管中回收溶液。苯酚/氯仿抽提后，寡核苷酸可被乙醇沉淀回收。
4. 为同时离散化不同链套，一次反应可使用一个以上的寡核苷酸。
5. 为制备电穿孔感受态细胞，离心瓶、移液管和缓冲液用前必须冷藏。
6. 封闭前，对照孔必须用无目标分子的缓冲液涂覆。噬菌体对没有经受缓冲液涂覆步骤，只是简单地用 BSA 封闭的孔壁，只有显著低结合活性。
7. DNA 测序用模板，可从酵母菌落用 PCR 扩增来产生。这种情况下，在开始扩增循环之前，在 96°C 加热 PCR 反应混合物 8 min。
8. β-半乳糖苷酶测试可用 96 孔格式板实现。用深孔板（每孔 1.2 ml) ，在半体积中完成反应。β-半乳糖苷酶反应停止和在一摇摆转子上以 2200 g [ 3000 r/min，用 JS-5.3 ( Beckman) 或等效转子 ] 离心 96 孔板 10 min 之后，转移 300 μl 上清液到 96 孔板，并用读板器测定 OD420。
9. 为得到独体的高产率，使用新鲜转化的 BL21 ( DE3 ) 细胞。
参考文献
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蛋白质工程的一个主要目的是生产能够与特定靶分子结合的新的生物分子。这样的分子会应用于生物技术的许多领域，包括诊断、治疗和催化。虽然存在大量的天然蛋白，可供这些应用和开发，但用工程手段制造新的、有用的生物分子的办法仍是有吸引力的。 因为，它不受天然生物分子可用性的限制。抗体的基本构架中可变的链套呈现在基本不变的框架上，以及抗体工程的成功启发了一些研究组去发展“分子框架”[ 1，2] 。这些努力的主要目标一直是在保留呈递多重肽片段以与靶分子结合的能力的同时，克服抗体和抗体片段的缺点，包括大尺寸、杂二聚特性（除单免疫球蛋白结构域外)、低构象稳定性和难于大规模生产。至今已发展出来的，这样的人工分子都是基于免疫球蛋白片段或者小单体蛋白。
我们发展了以纤连蛋白 Ⅲ 型结构域（FN3 ) 为分子框架的应用。纤连蛋白是一个大蛋白，在胞外基质生成和细胞间相互作用中起基本的作用。它由多次重复的 3 类（、Ⅱ 和 Ⅲ ) 小结构域组成 [3]。FN3 是广泛存在的结构域，在所有动物蛋白中，其出现率估计为 2% [4]。在人纤连蛋白中，有 15 个 FN3 的重复单位。我们的系统建立在 FNfn10 之上。FNfn10 是小的（94 个残基 ）单体，且不含二硫键。正确折叠的 FNfn10 在细菌中的高表达是很容易的 [5]。FNfn10 的三维结构 [ 6，7] 最好描述为 β 三明治，类似于抗体重链结构域的易变结构域，只是 FNfn10 有 7 条 β 链，而不是 9 条（ 图 6.1)。FNfn10 在其两端各含 3 条表面链套，具有载呈多重肽片段的能力。FNfn10 的这些特性使其成为分子框架的理想候选者。
我们证明了通过筛选离散化表面链套残基的 FNfn10 组合库，可以设计制造出新结合蛋白（称为独体），得到的独体，保留框架蛋白的整体结构和良好的构象稳定性 [8]。此外，因为 FNfn10 不需要二硫键来协助恰当的折叠和维持稳定性，所以独体兼容于任何筛选方法，包括噬菌体展示 [8]，肽-核糖核酸融合 [9] 和体内方法，如酵母双杂交系统 [ 10 ]。我们还证明了独体可以很容易地用于细胞内 [10] 。
我们在本章描述构建组合库、用噬菌体展示和酵母双杂交技术筛选蛋白库和用细菌生产独体的方法。
2. 材料
2.1 培养基
( 1 ) Luria-Bertani ( LB )：每升水加 10 g 菌用胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物和 10 g 氯化钠，pH 7.0。用平板时，加 15 g/L 菌用琼脂糖。
( 2 ) SOC：将 20 g 胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物和 0.5 g 氯化钠溶于约 900 ml 水中；加入 10 ml 250 mmol/L 氯化钾和 5 ml 2 mol/L 氯化镁；并将最终体积调至 1 L。高压灭菌、冷却，并加入 20ml 1 mol/L 葡萄糖，用 0.2 μm 滤膜过滤除菌。
( 3 ) 2 x YT：每升水加入 16 g 菌用胰蛋白胨、10 g 酵母抽提物，pH 7.0。
( 4 ) Superbroth ( 超级肉汤）：每升水加入 12 g 菌用胰蛋白胨、24 g 酵母抽提物和 5 g 甘油。高压灭菌后加 50 ml 含有 0.17 mol/L 磷酸二氢钾和 0.72 mol/L 磷酸氢二钾的灭菌溶液。
( 5 ) M9-胰蛋白胨：将 6.4 g 7 水合磷酸氢二钠、1.5 g 磷酸二氢钾、0.25 g 氯化钠、0.5 g 氯化铵和 5 g 菌用胰蛋白胨在 500 ml 水中混合，灭菌。冷却至 50°C，并加入 5 ml 50% 葡萄糖、1 ml 1 mol/L 硫酸镁和 50 μl 1 mol/L 氯化钙。
( 6 ) 抗生素最终浓度：100 μg/ml 氨苄青霉素（Ap)；30 μg/ml 氯霉素和 10 μg/ml 四环素（Tc )。
( 7 ) 基本硫酸卡那霉素（Km ) 板：将 6 g 菌用琼脂糖混入 320 ml 水中并灭菌，然后冷却至 50°C。在另外一瓶中加入 4.2 g 磷酸氢二钾、1.8 g 磷酸二氢钾、0.4 g 硫酸铵、0.2 g 柠檬酸钠和 64 ml 水，灭菌后冷却至 50°C。加入 64 ml 培养基到这个瓶中，4 ml 10 mg/ml 尿嘧啶、1.6 ml 50% 葡萄糖、0.32 ml 1 mol/L 硫酸镁、0.66 ml 30 mg/ml Km 和 20 μl 100 mg/ml 硫胺。
( 8 ) 酵母抽提物-蛋白胨-葡萄糖（YPD)：20 g 蛋白胨、10 g 酵母抽提物和 20 g 葡萄糖溶于 1 L 水中。用平板时，加入 20 g/L 菌用琼脂糖。
( 9 ) 酵母全价（YC) 葡萄糖 leu- his- trp - ura - : 为得到 1 L 试剂，混合 1.2 g 的无氨基酸无硫酸铵酵母氮源（Difco) ，5 g 硫酸铵、10 g 琥珀酸、6 g 氢氧化钠、0.6 g 全价补充混合物- leu- his- trp - ura- (Q- BIOgene)、0.1 g 半胱氨酸和 960 ml 水，并灭菌。加入 40 ml 灭菌的 50% 葡萄糖并彻底混合。用平板时，加入 20 g/L 菌用琼脂糖。
( 10 ) YC Glc his-ura-trp-：灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸到 YC Glc leu - his- trp - ura- 培养基中。
( 11 ) YC Glc trp -：灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸、0.05 g 组氨酸和 0.1 g 尿嘧啶到 YC Glc leu- his- trp - ura- 培养基中。
( 12 ) YC Glc his - ura- : 灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸到 YC Glc leu - his- trp - ura - 培养基中，并用 910 ml 水而不是 960 ml 水。灭菌后，加入 50 ml 灭菌的 2 mg/ml 色氨酸溶液。
( 13 ) YC 半乳糖蜜三糖 leu- his- trp - ura-：在 YC Glc leu- his- trp- ura- 培养基中用 100 ml 灭菌 20% 半乳糖和 50 ml 灭菌 20% 蜜三糖代替葡萄糖。用 850 ml 水而不是 960 ml。
( 14 ) YC Gal Raf his- trp - ura-：灭菌前，加入 0.1 g 亮氨酸到 YC Gal Raf leu- his-trp- ura- 培养基中。
2.2 试剂
( 1 ) 聚乙二醇（PEG) /氯化钠溶液：混合 66.6 g PEG 8000，78 g 氯化钠和 317 ml 水并灭菌。
( 2 ) HEPES 缓冲液：1 mmol/L HEPES，pH 7.0 (HEPES：N2-羟乙基哌嗪-N'-乙烷-硫酸）。
( 3 ) 涂布溶液：20 μg/ml 配体溶于 0.1 mol/L 碳酸氢钠，pH 8.6。
( 4 ) Tris 缓冲盐水（TBS )：50 mmol/L Tris - 氯化氢和 150 mmol/L 氯化钠，pH 7.5。
( 5 ) TBS-Tween-20 ( TBST): TBS 和 0.5% ( V/V ) Tween-20。
( 6 ) 5% 灭菌牛血清蛋白（BSA) : 过滤除菌的 BSA 于水中并储藏在 4°C。
( 7 ) TBST- BSA: TBST 加入 1 mg/ml BSA。
( 8 ) 酸性洗脱缓冲液：0.1 mol 氯化氢，加入甘氨酸和 1 mg/ml BSA，酸碱度调至 pH 2.2。
( 9 ) 2 mol/L Tris-碱。
( 10 ) 琼脂糖-磷酸溶液：每板混合 8 ml 水、2 ml 0.5 mol/L 磷酸钾缓冲液，pH 7.0，0.07 g 琼脂糖（根据平板的数量，加倍用量）。
( 11 ) 2 X β-半乳糖苷酶检验溶液：120 mmol/L 磷酸氢二钠、80 mmol/L 磷酸二氢钠、20 mmol/L 氯化钾、2 mmol/L 硫酸镁、0.54% β-巯基乙醇、0.0008% 十二烷基硫酸钠、8 mg/ml 2-硝基苯-β-D-半乳糖苷，pH 7.0。等分为小份存储于 -20°C。
( 12 ) 缓冲液 B : 20 mmol/L Tris - 氯化氢，pH 8.0，500 mmol/L 氯化钠。
( 13 ) 缓冲液 C : 20 mmol/L Tris- 氯化氢 ，pH 8.0，500 mmol/L 氯化钠和 500 mmol/L 咪唑。
( 14 ) 缓冲液 D : 50 mmol/L 磷酸钠和 500 mmol/L 氯化钠，pH 8.0。
( 15 ) Tris-氯化氢-EDTA (TE) 缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢和 1 mmol/L EDTA，pH 8.0。
( 16 ) 50 X Tris-乙酸盐- EDTA 缓冲液：溶解 242 g Tris-碱、57.1 ml 冰乙酸和 18.6 g EDTA 于重蒸水中至终体积 1 L。调节 pH 至 8.3。
( 17 ) 大肠杆菌菌株：CJ236 (Bio- Rad) 、KC8 (Origene)、XL-1 Blue (Stratagene) 和 SS-320 ( 见参考文献 [ 11 ] ; 注 1)。
( 18 ) 酵母菌株：EGY48 和 RFY206 ( Origene；参考文献 [ 12 ] 和 [ 13 ])。
2.3 载体
( 1 ) pAS38 : 融合于 M13 基因 III 的 C 端结构域的编码 FNfn10 的 pBluescript SK ( + ) 噬粒（ Stratagene) 的衍生物。我们用大肠杆菌偏好密码子构建了 FNfn10 基因 [8] 。这是为了独体的单价展示。此载体的 PvuⅡ 片段在与 pBluescriptSK ( + ) 的相反方向。
( 2 ) pAS45：从 pET15b (Novagen) 衍生的独体表达质粒。它表达带有 His 标签的独体融合蛋白。独体基因含有一个 Arg 6 到 Thr 的突变，为了消除凝血酶的一个酶切位点，从一开始就已引入 [8]。
( 3 ) pAS47: 在 FG-链套区含有一终止密码子的 PAS38 的衍生物（图 6.1A )。这是为了在构建 FG-链套区残基离散化的实物库时用作突变模板。
( 4 ) JCFN : 编码独体 -基因 V III 融合蛋白的 JC- M13-88M 的衍生物。这是为独体多价展示用的 M13 噬菌体体系。
( 5 ) pYT45 : 编码 B42 (激活蛋白）- 独体融合蛋白的 pYesTrp2 (Invitrogen ) 的衍生物 [10，15 ] 。这是用来构建酵母双杂交筛选用的独体库（见注 2 )。
( 6 ) PSH18-34：酵母双杂交筛选用的 LacZ 报告质粒（Origine) 。
( 7 ) pEG202：酵母双杂交筛选用的 LexA-诱饵质粒（Origine；见注 2 )。
独体质粒和实物库可从通信作者处得到。
4. 注
1. SS-320 不是商品，但按照 Sidhu 等的操作工艺很容易合成。
2. 我们选择 pYeSTrp2 作为捕食质粒（相对于诱饵而言-译者），主要是因为在这一质粒中存在允许 Kunkel 突变的 f1 起点。我们选择 pEG202 为诱饵质粒，因为该质粒在酵母中的维护较易，且较 pHybLex (Invitrogen ) 经济，后者需要 zeocin 抗生素。
3. 寡核苷酸的电洗脱。在一端用管夹封闭的透析管（MWCO 3500，18 mm 宽）中，加入凝胶片和 1.8 ml TE 缓冲液，然后在清除气泡后，用另一管夹封闭开口。将凝胶片放在透析管的一边，并淹没整个装置于一装满 1 X Tris-乙酸盐- EDTA 缓冲液的凝胶盒中。用 200 V 电压，电洗脱寡核苷酸 10 min。从管中回收溶液。苯酚/氯仿抽提后，寡核苷酸可被乙醇沉淀回收。
4. 为同时离散化不同链套，一次反应可使用一个以上的寡核苷酸。
5. 为制备电穿孔感受态细胞，离心瓶、移液管和缓冲液用前必须冷藏。
6. 封闭前，对照孔必须用无目标分子的缓冲液涂覆。噬菌体对没有经受缓冲液涂覆步骤，只是简单地用 BSA 封闭的孔壁，只有显著低结合活性。
7. DNA 测序用模板，可从酵母菌落用 PCR 扩增来产生。这种情况下，在开始扩增循环之前，在 96°C 加热 PCR 反应混合物 8 min。
8. β-半乳糖苷酶测试可用 96 孔格式板实现。用深孔板（每孔 1.2 ml) ，在半体积中完成反应。β-半乳糖苷酶反应停止和在一摇摆转子上以 2200 g [ 3000 r/min，用 JS-5.3 ( Beckman) 或等效转子 ] 离心 96 孔板 10 min 之后，转移 300 μl 上清液到 96 孔板，并用读板器测定 OD420。
9. 为得到独体的高产率，使用新鲜转化的 BL21 ( DE3 ) 细胞。
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