转基因作物田间试验的设计与管理
丁香园
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1. 引言
在过去十年中，遗传转化手段已经成为常用的拓展植物育种的遗传变异的方法之一 。随着小麦的转化技术体系的发展，育种家可以获得丰富的转基因的基因型，诸如提高抗生物和非生物逆境、改良品质性状的转基因植物，其对育种家开发新的种质是很有帮助的。然而，分析外源基因对这一性状的各种表现型的影响，仍需要进行田间试验。Bairo 等 [ 2 ] 发现在田间试验中，转基因株系与非转基因的亲本相比，在农艺性状和产量构成因子上表现出细微的差异；相反，Rakszegi 等 [ 3 ] 分析转基因的 B73-6-1 与其亲本非转基因的 L88 - 6 时，发现这两个株系间产量性状上并没有任何差异。Sharp 等 [ 4 ] 的结果认为，Wsm I 基因提供了小麦梭条花叶病毒最强的抗性，但经田间试验表明，转入该基因会导致 11%~28% 的减产。尽管插入的位点可能会不相同，后代的分离比例也不一定符合孟德尔基因分离比例，但转入的基因通常在几代表现为显性性状 [ 5 ] 。这一点正可以解释为什么在转基因的遗传学分析时，至 T5 代还会发现杂合基因型和纯合基因型同时存在的现象 [ 6 ] 。
育种家可以运用田间育种方法，通过与非转基因的亲本回交，使回交后代具有与亲本相似的表型；也可将导入的基因转育至二代转基因作物基因型中。这些转基因株系都需要在大田间条件下繁殖足够数量的种子，用于详细地分析相关的目标性状。与常规育种方法相比，转基因材料的田间测试会有某些特殊要求，如环境风险评估。本章节旨在叙述转基因小麦田间试验的管理和设计，并顾及这些的特殊要求。
2. 材料
田间试验适用于转基因育种计划的若干阶段。
2.1 候选植株的种植
候选转基因植株是指已完成遗传转化，但尚未验证的植株（T0 代），一般种植于封闭的温室中。但当日常的育种试验需要大量的株系时，也可以采用田间试验。
2.2 T1~Tn 代转基因株系的种植
为了获得稳定的纯合个体，需将不同世代的转化植株种植于田间的育种圃。经对转基因植株的基因分离和基因沉默的检测后，验证的转化株最好种植在穗行试验区。在一些特例中，可用单粒传 （ single seed descent, SSD) 进行世代的加代，但这项技术一般只限于在温室中操作。如果研究目标是创建新的遗传种质，或者是培育转基因新品种的话，那么导入的外源基因的整合和遗传必须是稳定的。
2.3 转育的群体和株系的测定
培育回交（BC) 后代是将导入的基因转入非转基因材料的重要育种方法，尤其对组培再生能力差、转化频率低的回交亲本更为重要。运用这一方法时，可选用再生能力好但育种价值不高的基因型作为转基因受体。回交法仅用于促使转基因株系与它们非转基因的原始亲本的性状趋于一致 [ 7 ] 。
2.4 农艺性状表现的检测
利用纯合后代的群体，如 T4 代或更高世代，可以测定所培育的转基因系的农艺性状和抗性的表现。测定在各种环境下转基因系与非转基因的原始亲本的表型反应，明确转基因系的适应性和抗性机理。在这个试验中，需要在田间条件下鉴定转基因系对赤霉病的抗病反应，原因是田间的病原菌致病性往往比温室环境强 [ 8 ] 。
2.5 纯合转基因系作为商业化品种登记所需的检测
需要对纯合转基因系进行 DUS 测定 和 VCU 评价，以符合国际植物新品种保护联盟 UPOV 的规定。
4. 小结
转基因释放的法律条件：转基因植物释放到环境中，如田间试验需要特别的许可证。在大多数国家，特别是欧盟成员国，许可证只能由基因技术权威部门发放给有资质的责任单位，他们具备开展转基因释放试验相应的设施与条件。环境释放许可证准许在特定的生物体（如物种、品种等） 和特定的基因插入事件中，在规定的释放条件下、限定的期限内开展试验。这些特殊要求是根据欧盟条例 2003/701/EC [ 1 ] 中对高等植物转基因环境释放的法律条文制定的。
参考文献
1. EU Directive 2003/701/EC. Commission decision of 29 September 2003. Establishing pursuant to Directive2001/18/EC of the European Parliament and of the Council a format for presenting the results of the deliberate release into the environment of genetically modified higher plants for purposes other than placing on themarket. ( notified under document number C (2003) 3 4 05).
2. Barro, F ., Barcelo, P ., Lazzeri, P. A., Shewry, P. R ., Martin, A. and Ballesteros, J. (2003) Functionalproperties and agronomic performance of transgenic Tritordeum expressing high molecular weight gluteninsubunit genes lAxl and 1Dx5. J. Cereal ScL 37, 65-70.
3. Rakszegi, M., Bekes, F ., Lang, L ., Tamas, L., Shewry, P. R. and Bed?, Z. (2005) Technological qualityof transgenic wheat expressing an increased amount of a HMW subunit of glutenin. J. Cereal ScL 4 2, 15-23.
4. Sharp, G. L ., Martin, J. M ., Lanning, S. P ., Blake, N. K ., Brey, C. W ., Sivamani, E ., Qu, R. and Talbert, L. E. (2002) Field evaluation of transgenic and classical sources of wheat streak mosaic virus resistance. Crop Sci. 4 2, 105-110.
5. Lrz, H ., Becker, D. and Lutticke, S. ( 1998) Molecular wheat breeding by direct gene transfer. Euphytica100, 219-223.
6. Rooke, L ., Steele, S. H ., Barcelo, P . , Shewry, P. R. and Lazzeri, P. A. (2003) Transgene inheritance,segregation and expression in bread wheat. Euphytica 129, 301-309.
7. Barro, F ., Barcelo, P ., Lazzeri, P. A., Shewry, P. R ., Martin, A. and Ballesteros, J. (2002) Field evaluation and agronomic performance of transgenic wheat. Theor. AppL Genet. 105 ， 980-984.
8. Anand, A., Zhou, T ., Trick, H. N ., Gill, B. S ., Bockus, W. W. and Muthukrishnan, S. (2003) Greenhouse and field testing of transgenic wheat plants stably expressing genes for thaumatin-like protein, chitinaseand glucanase against Fusarium graminearum. J. Exp. Bot. 5 4 , 1101-1111.
9. Komari, T ., Hiei, Y ., Saito, Y ., Murai, N. and Kumashiro, T. (1996) Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of trans-form-ants free from selection markers. Plant J. 10, 165-174.
10. Ebinuma, H ., Sugita, K ., Matsunaga, E ., Endo, S ., Yamada, K. and Komamine, (2001) Systems forthe removal of a selection marker and their combination with a positive marker. Plant Cell Rep. 20,383-392.
在过去十年中，遗传转化手段已经成为常用的拓展植物育种的遗传变异的方法之一 。随着小麦的转化技术体系的发展，育种家可以获得丰富的转基因的基因型，诸如提高抗生物和非生物逆境、改良品质性状的转基因植物，其对育种家开发新的种质是很有帮助的。然而，分析外源基因对这一性状的各种表现型的影响，仍需要进行田间试验。Bairo 等 [ 2 ] 发现在田间试验中，转基因株系与非转基因的亲本相比，在农艺性状和产量构成因子上表现出细微的差异；相反，Rakszegi 等 [ 3 ] 分析转基因的 B73-6-1 与其亲本非转基因的 L88 - 6 时，发现这两个株系间产量性状上并没有任何差异。Sharp 等 [ 4 ] 的结果认为，Wsm I 基因提供了小麦梭条花叶病毒最强的抗性，但经田间试验表明，转入该基因会导致 11%~28% 的减产。尽管插入的位点可能会不相同，后代的分离比例也不一定符合孟德尔基因分离比例，但转入的基因通常在几代表现为显性性状 [ 5 ] 。这一点正可以解释为什么在转基因的遗传学分析时，至 T5 代还会发现杂合基因型和纯合基因型同时存在的现象 [ 6 ] 。
育种家可以运用田间育种方法，通过与非转基因的亲本回交，使回交后代具有与亲本相似的表型；也可将导入的基因转育至二代转基因作物基因型中。这些转基因株系都需要在大田间条件下繁殖足够数量的种子，用于详细地分析相关的目标性状。与常规育种方法相比，转基因材料的田间测试会有某些特殊要求，如环境风险评估。本章节旨在叙述转基因小麦田间试验的管理和设计，并顾及这些的特殊要求。
2. 材料
田间试验适用于转基因育种计划的若干阶段。
2.1 候选植株的种植
候选转基因植株是指已完成遗传转化，但尚未验证的植株（T0 代），一般种植于封闭的温室中。但当日常的育种试验需要大量的株系时，也可以采用田间试验。
2.2 T1~Tn 代转基因株系的种植
为了获得稳定的纯合个体，需将不同世代的转化植株种植于田间的育种圃。经对转基因植株的基因分离和基因沉默的检测后，验证的转化株最好种植在穗行试验区。在一些特例中，可用单粒传 （ single seed descent, SSD) 进行世代的加代，但这项技术一般只限于在温室中操作。如果研究目标是创建新的遗传种质，或者是培育转基因新品种的话，那么导入的外源基因的整合和遗传必须是稳定的。
2.3 转育的群体和株系的测定
培育回交（BC) 后代是将导入的基因转入非转基因材料的重要育种方法，尤其对组培再生能力差、转化频率低的回交亲本更为重要。运用这一方法时，可选用再生能力好但育种价值不高的基因型作为转基因受体。回交法仅用于促使转基因株系与它们非转基因的原始亲本的性状趋于一致 [ 7 ] 。
2.4 农艺性状表现的检测
利用纯合后代的群体，如 T4 代或更高世代，可以测定所培育的转基因系的农艺性状和抗性的表现。测定在各种环境下转基因系与非转基因的原始亲本的表型反应，明确转基因系的适应性和抗性机理。在这个试验中，需要在田间条件下鉴定转基因系对赤霉病的抗病反应，原因是田间的病原菌致病性往往比温室环境强 [ 8 ] 。
2.5 纯合转基因系作为商业化品种登记所需的检测
需要对纯合转基因系进行 DUS 测定 和 VCU 评价，以符合国际植物新品种保护联盟 UPOV 的规定。
4. 小结
转基因释放的法律条件：转基因植物释放到环境中，如田间试验需要特别的许可证。在大多数国家，特别是欧盟成员国，许可证只能由基因技术权威部门发放给有资质的责任单位，他们具备开展转基因释放试验相应的设施与条件。环境释放许可证准许在特定的生物体（如物种、品种等） 和特定的基因插入事件中，在规定的释放条件下、限定的期限内开展试验。这些特殊要求是根据欧盟条例 2003/701/EC [ 1 ] 中对高等植物转基因环境释放的法律条文制定的。
参考文献
1. EU Directive 2003/701/EC. Commission decision of 29 September 2003. Establishing pursuant to Directive2001/18/EC of the European Parliament and of the Council a format for presenting the results of the deliberate release into the environment of genetically modified higher plants for purposes other than placing on themarket. ( notified under document number C (2003) 3 4 05).
2. Barro, F ., Barcelo, P ., Lazzeri, P. A., Shewry, P. R ., Martin, A. and Ballesteros, J. (2003) Functionalproperties and agronomic performance of transgenic Tritordeum expressing high molecular weight gluteninsubunit genes lAxl and 1Dx5. J. Cereal ScL 37, 65-70.
3. Rakszegi, M., Bekes, F ., Lang, L ., Tamas, L., Shewry, P. R. and Bed?, Z. (2005) Technological qualityof transgenic wheat expressing an increased amount of a HMW subunit of glutenin. J. Cereal ScL 4 2, 15-23.
4. Sharp, G. L ., Martin, J. M ., Lanning, S. P ., Blake, N. K ., Brey, C. W ., Sivamani, E ., Qu, R. and Talbert, L. E. (2002) Field evaluation of transgenic and classical sources of wheat streak mosaic virus resistance. Crop Sci. 4 2, 105-110.
5. Lrz, H ., Becker, D. and Lutticke, S. ( 1998) Molecular wheat breeding by direct gene transfer. Euphytica100, 219-223.
6. Rooke, L ., Steele, S. H ., Barcelo, P . , Shewry, P. R. and Lazzeri, P. A. (2003) Transgene inheritance,segregation and expression in bread wheat. Euphytica 129, 301-309.
7. Barro, F ., Barcelo, P ., Lazzeri, P. A., Shewry, P. R ., Martin, A. and Ballesteros, J. (2002) Field evaluation and agronomic performance of transgenic wheat. Theor. AppL Genet. 105 ， 980-984.
8. Anand, A., Zhou, T ., Trick, H. N ., Gill, B. S ., Bockus, W. W. and Muthukrishnan, S. (2003) Greenhouse and field testing of transgenic wheat plants stably expressing genes for thaumatin-like protein, chitinaseand glucanase against Fusarium graminearum. J. Exp. Bot. 5 4 , 1101-1111.
9. Komari, T ., Hiei, Y ., Saito, Y ., Murai, N. and Kumashiro, T. (1996) Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of trans-form-ants free from selection markers. Plant J. 10, 165-174.
10. Ebinuma, H ., Sugita, K ., Matsunaga, E ., Endo, S ., Yamada, K. and Komamine, (2001) Systems forthe removal of a selection marker and their combination with a positive marker. Plant Cell Rep. 20,383-392.
