PCR技术（十二）：PCR

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随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问 世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 PCR产物的直接测序 、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成 为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件 高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交叉污 染情况，以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用.

一、SSCP的原理及特点

　　日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序 ;电泳条件要求较严格;另外，由 于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该 方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 基突变.Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发 现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步 提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.

二、SSCP的不断改进

　　SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达90%以上.另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较 长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.

　　为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变 检测方法相结合.其中与杂 交双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用 探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便.

三、PCR -SSCP的实验操作

　　在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

DNA片段长度(核苷酸数)丙烯酰胺(%)1Kb～700b3.5700b～500b5500b～200b8200b12

　　在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).