胰酶分离提取，进口胎牛血清提取制备酶的经典方法

进口胎牛血清提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在 75% 饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在 10% 硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，后在 PH8.0peng 酸缓冲液中得到结晶。

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

1、胰蛋白酶原的提取与分离：称取 1－1.5 Kg 新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏 (或用高速组织匀浆机捣碎) 加 1－2 倍体积以预冷却的 PH2.5 - 3.0 乙酸酸化水溶液提取 (按 1 g 组织相当于 1 ml 体积计算，以此类推)。检查提取液中 PH，若高于 PH3.0 时应及时用 10% 乙酸调节，使提取液维持 PH2.5－3.0 之间。在冷室 5℃ 左右搅拌提取 18－24 h，而后用 4 层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约 300 mlpH2.5 乙酸酸化水再提取残渣一次 (时间约为 1－2 h)，合并滤液，此时滤液 PH 值较高，可用 5M H₂PO₄ 溶液调整 PH 至 2.5－3.0，放置 3－5 h 后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物。

2、盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至 75% 饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日用 4000r/min 离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约 20 g 胰蛋白酶原粗制品。

3、胰蛋白酶原得激活：将胰蛋白酶原粗制品用 10 倍体积得冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出 1 ml 溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量 (约为滤饼重得 1 / 4)。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体 CaCL₂ 慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用 5MNaOH 溶液调 PH 至 8.0。在酶溶液加入约 5 mg 结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置 5℃ 冰箱中使酶原活化。

4、纯化：去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用 5M 硫酸溶液调节滤液 PH 至 2.5－3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约 1000 ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达 40% 饱和度 (每升滤液加 242 g 硫酸铵)。放置 5℃ 冰箱中 5－8 h, 抽滤除去沉淀。