支原体培养的问与答

一、简介：

支原体的大小为 0.1～0.3μm，可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。菌落小（直径 0.1~1.0 mm），在固体培养基表面呈特有的「油煎蛋」状。无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。

革兰氏染色不易着色，故常用 Giemsa 染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占 36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。细胞膜含甾醇，比其他原核生物的膜更坚韧。凡能作用于胆固醇的物质（如两性霉素 B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。

支原体基因组为一环状以双链 DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。

肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminal structure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病性有关。

生化反应与分型：

一般能分解葡萄糖的支原体则不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类。解脲支原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。

各种支原体都有特异的表面抗原结构，很少有交叉反应，具有型特异性。应用生长抑制试验（Growth inhibition test,GIT）、代谢抑制试验（Metabolic inhibition test,MIT）等可鉴定支原抗原，进行分型。

它广泛分布于自然界，有 80 余种。与人类有关的支原体有肺炎支原体（M-pneumonie，Mp）、人型支原体（UU 分解尿素支原体）和生殖器支原体（M.genitalium，MG）等。

肺炎支原体引起肺炎。现已从人类泌尿生殖道分离出来 7 种支原体，其中分离率较高而与泌尿生殖道疾病有关，是解脲支原体，其次是人型支原体。人型支原体（M.humenis，MH）、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，UU）和生殖器支原体（M.genitalium，MG）都会引起泌尿生殖道感染。

自然界中广泛存在绝大多数生长需胆固醇，在遗传上与细菌无关，且无论在什么条件下也不能变成细菌菌落较小，0.1～0.3 mm。

培养条件：

营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入 10～20% 人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适 pH7.8～8.0 之间，低于 7.0 则死亡，但解脲支原体最适 pH 6.0～6.5。

大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入 5% CO2 生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育 2～3 天出现典型的「荷包蛋样」菌落：圆形（直径 10～16μm），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。此外，支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。

二、常见问题：

1、你好，请问我想要根据药典 2010 三部做支原体检测，需要哪些培养基？精氨酸支原体肉汤培养基的作用是什么？ 药典上说用支原体肉汤培养基，想问问是否带精氨酸，还有支原体琼脂培养基是需要含精氨酸吗？我们是检测看我们的培养的细胞是不是支原体污染了？

答：

1） 药典 2010 三部做支原体检测需要支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基 (或支原体琼脂培养基)。

作验证试验时：支原体肉汤培养基是用来培养肺炎支原体，利用葡萄糖变黄，则有肺炎支原体的生长，如果要分离，则接种到支原体琼脂培养基上。

精氨酸支原体肉汤培养基是用来培养口腔支原体，利用精氨酸变红，则有口腔支原体的生长，如果要分离，则接种到精氨酸支原体琼脂培养基上。

2）支原体肉汤培养基和支原体琼脂培养基不含精氨酸。

3）支原体的生长现象是观察液体是否变色，培养后的液体仍是澄清，不是变混浊生长，如果变混浊生长，说明有细菌污染，正常是抑制细菌生长的。

2、想分离支原体。不知如何选择培养基？

答：首先应确定分离哪种支原体。是利用葡萄糖、精氨酸，还是尿素？

利用葡萄糖的支原体：肺炎支原体----支原体肉汤培养基；利用精氨酸的支原体：口腔支原体、唾液支原体、人型支原体----精氨酸支原体肉汤培养基；利用尿素的支原体：T 株支原体 (解脲支原体)—--解脲支原体培养基鸡毒支原体------改良 Frey 培养基用于固体培养时：以上支原体都可以接种于支原体琼脂培养基上。

3、改良 Frey 培养基是直接用于培养支原体吗？

答：用于培养滑液支原体及其他禽支原体用。

4、那如果有支原体的话是不是改良 Frey 培养基液体会变色呢？

答：是的，改良 Frey 培养基中含有葡萄糖和苯酚红，当支原体利用葡萄糖时会产酸，使 pH 值下降，溶液颜色变黄，且溶液是澄清的。

5、我们是用来培养山羊支原体的，一直没培养出来。

答：可能培养条件不够，例血清质量不好；CO2 浓度为 5%-10%、N2 浓度为 95% 时生长良好。

6、你好，我刚才在你们网站搜支原体培养基，发现有多种，解脲支原体培养基 100 ml 600 元，但是支原体培养基础 250 g 300 元。用支原体培养基础可以培养解脲脲原体吗。

答：可以的；我们的解脲支原体培养基是生产好的成品培养基，可直接使用。

7、您好，我想问一下，我配的培养基养支原体泛粉红是什么原因？

答：培养基含有苯酚红，用来观察支原体是否生长？若变色且溶液是澄清的，可以判为有支原体生长。

8、请问您那里有支原体培养基的平板吗？

答：建议你们自己制作，因为培养时间长，平板易失水。

9、你好，我们公司最近做支原体检测，PCR 法，但是药典方法也想做一下看到药典的支原体检测方法，看到你家有支原体肉汤培养基，想问一下，你们公司是否针对你们的产品进行过支原体肉汤培养基的灵敏度检测同时，以前定的培养基都是北京中检所指定的，但是他们没有支原体肉汤培养基，但是有其他的针对相关支原体的培养基。

答：做过灵敏度试验，肺炎支原体达到 10-8 变色单位，口腔支原体达到 10-4 变色单位。

10、咨询一下，支原体肉汤培养基针对的支原体有哪几种？还是所有支原体均可培养？

答：利用葡萄糖的支原体，例肺炎支原体等。

11、支原体一般培养一般需要多长时间？

答：支原体培养的时间比较长，生长快的 T 株支原体约需培养 1-3 天。中等生长的约需 7-14 天，慢的约需 21-30 天。

12、想买肺炎支原体培养基，HB7025-3 支原体琼脂培养基，是不是可以培养肺炎支原体呀？

答：HB7025-3 支原体琼脂培养基，是支原体固体平板培养法，可以培养肺炎支原体和口腔支原体。

13、HB7025-2 支原体肉汤培养基用法中「青霉素 80 万单位」是什么意思，指代不明确。

答：青霉素 80 万单位，是指青霉素的效价单位而不是重量单位。购买青霉素时在包装上都有说明。

14、培养鸡毒支原体和猪肺炎支原体用哪种培养基比较好？

答：培养鸡毒支原体用改良 Frey 培养基；培养猪肺炎支原体用支原体肉汤培养基或猪支原体培养基。

15、还有与 PPLO 肉汤配合用的培养基的资料能提供些吗？我现在需要复苏和传代肺炎支原体。

答：复苏可用 sp4 葡萄糖肉汤培养基，传代用 sp4 葡萄糖琼脂培养基。

16、问一下支原体固体培养基这个能检测鸡的支原体吗？

答：可以。

17、想检测细胞培养过程中，是否有支原体污染，可以用哪些培养基？

答：有，可以用支原体肉汤培养基和支原体半流体培养基。

18、支原体生长培养基颜色有什么变化？

答：支原体肉汤培养基和精氨酸支原体肉汤培养基配方中都含有苯酚红。若有支原体生长时，会使培养基 pH 值下降或上升，所以培养基颜色变黄 (支原体肉汤培养基) 或变红 (精氨酸支原体肉汤培养基)。

19、支原体培养基基础这个含有精氨酸和不含精氨酸的有什么区别，我们想要一种广谱的支原体培养基，建议是用含精氨酸的还是不含精氨酸的？

答：广谱支原体培养基就不能用含有苯酚红的培养基，可以用支原体半流体培养基或支原体琼脂培养基。

20、支原体培养基基础是添加马血清，青霉素那些还是支原体添加剂啊？

答：支原体培养基基础中不含马血清和青霉素，需在基础培养基高压灭菌后添加马血清和无菌青霉素溶液。

21、请问有支原体的菌株吗？

答：没有。

22、请问 您这里有鸡毒支原体基础培养基么？

答：有，改良 Frey 培养基。

23、我看公司的几种支原体培养基，成分有所不同，具体怎么回事儿呢？

答：针对不同来源的支原体，采用不同成份的支原体培养基，这样有利于不同来源支原体的生长和培养。

24、哪个是用于牛羊支原体的培养基？

答：可以 HB8572-2 支原体培养基，中国兽药标准。

25、你们公司有没有检测禽源疫苗的支原体培养基？

答：有，改良 FREY 氏培养基。

26、请问你们的支原体基础培养基配好之后能够鉴别支原体吗？

答：不能，可以做一些生化鉴定，例葡萄糖、精氨酸、尿素、TTC 还原、红细胞吸附等试验。

27、我看你们有多种支原体培养基，我不知道该买那种我看其他人做支原体培养，先用液体的，再用固体的。我上次直接买了固体的，我打算培养支原体，需要增菌培养。用液体的，需要买那种？

答：1) 支原体肉汤培养基 是用来培养肺炎支原体，利用葡萄糖变黄，则有肺炎支原体的生长，如果要分离，则接种到支原体琼脂培养基上。精氨酸支原体肉汤培养基是用来培养口腔支原体，利用精氨酸变红，则有口腔支原体的生长，如果要分离，则接种到精氨酸支原体琼脂培养基上。

28、你好，你那里有用做支原体生化鉴定的培养基么？

答：有，可以做

1）TTC 还原试验：肺炎支原体菌落呈粉红色或深红色；

2）葡萄糖、精氨酸、尿素试验；

3）3% 红细胞吸附试验：用鸡的红细胞，其中肺炎支原体、口腔支原体 I 和 III 型为吸附，阳性。

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