Ⅱ 相代谢稳定性研究原理及实验方法

1 概述

1.1 药物代谢研究简介

药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。

药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较「干净」，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。

由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组 P450 酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。

1.2 药物代谢

药物代谢，又称药物的生物转化（biotransformation），是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程，是药物从体内消除的主要方式之一。药物在体内的生物转化，分为 Ⅰ 相代谢反应和 Ⅱ 相代谢反应。

肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢 Ⅰ 相代谢和 Ⅱ 相代谢的各种酶。UGT 家族是人体内仅次于 CYP450 家族的第 2 大药物代谢酶。UGT 介导的葡萄糖醛酸结合代谢不仅会显著影响药物的口服生物利用度和药物的体内药动学过程，同时还与一些临床药物-药物相互作用、药物-草药相互作用、药物-食物相互作用，以及高胆红素血症、癌症、自身免疫性肝炎等多种疾病的发生发展密切相关。

UGT 催化的葡萄糖醛酸化代谢反应是以尿苷 5'-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的供体将一分子的葡萄糖醛酸转移到含有羟基、羧基、氨基、巯基以及酸性碳原子等基团的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的结合使这些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，进而更容易被排出体外。

1.3 药物的 Ⅱ 相代谢

药物的 Ⅱ 相代谢，又称结合反应，是药物在 Ⅱ 相代谢反应中与一些内源性的物质（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）结合或经甲基化、乙酰化排出体外。药物的结合反应，常常使其转化为无活性的代谢物，且极性增加，以便药物排出体外。

药物的结合反应包括葡萄糖醛酸结合、硫酸化、乙酰化、甲基化、谷胱甘肽结合、氨基酸结合及缩合反应等。葡萄糖醛酸结合反应是体内生物转化最重要、最普遍的结合反应。葡萄糖醛酸基的直接供体是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）（见图 1）。

图 1 葡萄糖醛酸结合反应

葡糖醛酸基转移酶（UGT）催化的葡萄糖醛酸化代谢反应是以尿苷 5'-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的供体，将一分子的葡萄糖醛酸转移到含有羟基、羧基、氨基、巯基以及酸性碳原子等基团的脂溶性小分子底物上，葡萄糖醛酸和小分子底物的结合使这些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，进而更容易被排出体外。

例（图 2）：

图 2α-D-UDP-葡糖醛酸和异源物的结合反应

例（图 3）：

图 3 苯甲酸的葡萄糖醛酸结合反应

一般来说，药物先进行 Ⅰ 相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动 Ⅱ 相反应，但有些药物可直接进行 Ⅱ 相反应。

2 实验原理

Ⅱ 相代谢，又称结合反应，指 Ⅰ 相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。在药物的 Ⅱ 相代谢中，与葡萄糖醛酸的结合反应最为常见，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）进行反应，形成葡萄糖苷酸，使其水溶性增加，易于排出体外。因此，在体外，如若加入肝微粒体和 UGT 系统，便可重建 Ⅱ 相代谢体系，从而进行 Ⅱ 相代谢稳定性研究。

3 肝微粒体体外温孵法实验方法描述

肝微粒体体外温孵法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用 HPLC、HPLC-MC 和 HPLC-MC/MC 测定温孵液中原型药物剩余含量的方法。

3.1 肝微粒体制备

微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图 4）：

图 4 肝微粒体制备流程图

3.2 体外孵育体系的建立

Ⅱ 相代谢稳定性研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。

推荐的孵育体系为：每个孵育体系总体积为 200 µL，体系包括 0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，NADPH 发生系统（1 mM NADP，5 mM 的 6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM 的氯化镁），UGT 孵育系统（5 mM UDPGA，5 mM D-葡萄糖二酸-1.4-内酯，50 μg/mg 蛋白的丙甲菌素），0.5 mg/mL 的肝微粒体蛋白，合适浓度的待测物，于 37°C 水浴孵育，每个样品平行 3 次，将待测物换为 7-羟基香豆素，作为阳性对照， 阴性对照组分三组：a. 只加 UDPGA；b. 只加 A 液、B 液；c. 不加 UDPGA、A 液、B 液。于预设的反应时间点，如 0，5，10，15，30，60 min 后加入等体积预冷的乙腈终止反应。

3.3 原型药物检测

采用 HPLC、HPLC-MC 和 HPLC-MC/MC 测定温孵液中原型药物的剩余含量。

4 智泰康医药 Ⅱ 相代谢稳定性试剂盒简介

北京汇智泰康医药技术有限公司针对药物代谢研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，开发了一款专门用于 Ⅱ 相代谢稳定性研究的试剂盒，该产品可直接用于药物的 Ⅱ 相代谢稳定性研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合 Ⅱ 相代谢稳定性研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。

4.1 产品说明

本产品提供了药物 Ⅱ 相代谢研究用到的肝微粒体、NADPH 再生系统、UGT 孵育系统及其它组分，可直接用于药物 Ⅱ 相代谢稳定性的研究。本产品可提供肝微粒体有：人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体，可根据实际需求，选择不同种属的肝微粒体。

4.2 试剂盒优势

便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。
准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。

4.3 产品组成

50 反应/盒，200 μL/反应。

4.4 产品使用说明

本产品需于 -70 ℃ 冰箱冷冻保存，切记避免反复冻融。试验具体操作如下：

4.4.1 试验组

1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；
2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于 37 ℃ 预孵育 5 min；

例：200 μL 孵育体系配制：

注：
a. 体系中有机溶剂加入量不得大于 1%。
b. 若实际需要 n 个孵育体系，则需配置 n＋1 个体系。

3）将以上混合液 195 μL/管分装至 1.5 mL 离心管中，于 37 ℃ 水浴中保温， 5 μL/反应加入肝微粒体，吹吸 3 次混匀于 37 ℃ 水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时；
4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入 200 μL 预冷的乙腈终止反应（预冷乙腈：孵育体系体积 = 1:1）。

4.4.2 对照组

1）阳性对照组：将受试物换为阳性底物；
2）阴性对照组分三组：a. 只加 UDPGA；b. 只加 A 液、B 液；c. 不加 UDPGA、A 液、B 液；
3）空白对照：只包含底物和 PBS 缓冲液。

4.4.3 运输条件

干冰运输。

4.4.4 注意事项

1）试验开始前，请自行准备 1.5 mL 离心管、不同规格枪头、乙腈、37 ℃ 水浴锅等。
2）本产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断。
3）使用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀。
4）于 -70 ℃ 冰箱冷冻保存，切勿反复冻融。
5）在使用过程中，也可根据实际实验需求调整各组分的加入量。
6）D-葡萄糖二酸-1.4-内酯为葡萄糖醛酸结合物的水解抑制剂，可根据实际需求选择是否加入。

图片来源：汇智康泰