(交流)影响免疫组化染色结果的几个因素

免疫组化是一项简单而常用的实验技术，但要想获得良好的染色结果却也不是很容易，影响染色结果的因素有很多，现就我的实验过程总结如下：
一． 抗原修复
　组织在福尔马林或其它固定液中固定会引起位于蛋白或蛋白间的亚甲基桥的桥连,引起许多抗原决定簇被封，抗原修复以暴露抗原决定簇十分必要。足够的抗原修复是影响免疫组化染色结果最重要的因素,有时候甚至较检测系统更为重要。如在组织切片前未进行某种形式的抗原修复,免疫染色果将不能令人满意甚至不能成功。
常用的抗原修复方法有酶修复和热修复，目前大部分抗体采用热修复，其中的方法有微波法、高压法以及水煮法等。各种热修复具体操作方法就不多说了，但它们都存在一个不可避免的问题就是组织脱片，尤其以微波法明显。这里推荐两种方法以尽量减少脱片，毕竟对有的实验来说，组织切片来之不易。
1． 水煮法
所需仪器为电热恒温水槽。适量抗原修复液加入500ml烧杯中后，放入恒温箱水槽中一起加热，温度定为100℃，煮沸后将切片放入，维持约15-20m。
2． 电饭煲蒸汽法
适量抗原修复液加入铝质饭盒后，放入电饭煲蒸笼中，沸腾后将切片放入，维持约15-20m。
二． 抗体浓度和孵育时间
抗体浓度和孵育时间对染色结果影响很大，时间短、浓度低，染色弱且容易有假阴性；时间长、浓度高，容易出现非特异性染色。建议有条件的尽量用浓缩型抗体，其染色结果肯定要比即用型好，只是摸索一个合适的一抗浓度比较烦琐。一般来说，一抗的稀释浓度选1：50、1：100、1：200进行摸索就足够了。关于孵育时间，建议一抗最好是4℃冰箱过夜，二抗和三抗室温（20-25℃）孵育15m左右，如果室温过低，应该适当延长二抗和三抗的孵育时间。此外，抗原定位于核或核膜，二抗的时间可适当延长。
三DAB显色和苏木素复染时间
DAB显色以镜下出现棕黄色颗粒为准，具体时间依DAB浓度和其他因素而不同，切记当镜下出现棕黄色颗粒后应及时终止显色，否则背景也是一片黄色，影响染色结果判断。苏木素复染时间虽然对染色结果判断影响不大，但如果想有漂亮的免疫组化图片，也应该掌握苏木素复染的技巧。我的经验是复染30-60s，然后用0.1%盐酸酒精分化约5-10s。
需要说明的是，因为DAB和苏木素制剂不同，显色和复染的时间需根据实验结果不断调整。
四．其他
适当的PBS冲洗可使染色背景更加清晰，建议在冲洗一抗的时候先用0.1%Tween20-PBS(0.5ml Tween20用PBS定容至500ml)，然后PBS冲洗两遍。此外，对于定位于核或核膜的抗原，可在孵育一抗是加入Triton，Triton可穿透核膜，起到一个“打孔机”的作用，有利于抗体和抗原的结合。还有一点一定要注意的是，实验过程中切片切勿干燥，如果切片干了，这张片子就报废了！
免疫组化看似简单但要想染的漂亮却不容易，我知道的几个做的都抱怨以后再也不想做免疫组化了。我上面说到的几点肯定不全面，希望后来的朋友能给予补充！