影响酶切的几个主要因素
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影响酶切的几个主要因素:
1. 质粒DNA的质量 1)质粒DNA的质量是决定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆时,如果反复优化酶切条件后,都不能实现完全酶切,最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题。 2)DNA的质量监测通常有两个方法:首先OD260/OD280比值应该在1.8左右(1.7-1.9),否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次,琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带(分别为超螺旋DNA,线性化DNA和环状DNA)。否则意味质粒DNA的质量不高,应该重新制备。 2.限制性内切酶的活性 1)限制性内切酶一般需要低温保存,而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活,限制性内切酶的日常保存和使用应当很小心。 2)建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶(-20度),而且取用限制性内切酶时,也应该使用具有保温功能的冻存盒,尽量防止酶的温度反复出现大的波动。 3.限制性内切酶的用量 1)限制性内切酶的单位定义通常为:在合适的温度下,完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。 2)在这个单位定义中,有几个不确定因素:首先是底物,不同的酶单位定义是选择的底物可能不同(常用的几个底物DNA包括:Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA);第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化,因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少,就直接影响了该酶的单位定义。 3)因而,在进行酶切时,用1ul酶(一般10IU/ul)消化1ugDNA的通常做法是很不科学的,这也导致在实际工作中,大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。 4)以前,我推荐了一个在线的双酶切设计软件,double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中,能够注意到,用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍(EcoRI + NheI),而且发现,小片段PCR产物(100-500bp)进行酶切时,需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。 5)该软件目前可以免费使用,用户名和密码都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php (责任编辑:大汉昆仑王) |