北京英茂盛业生物科技基因RNA干扰服务

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RNA干扰技术

北京英茂盛业生物科技有限公司专业从事分子 生物学技术服务 。我们提供从基因的合成、获取、表达载体 构建、蛋白表达 到基因RNA干扰，以及稳定细胞系筛选。其中慢病毒 包装、RNA干扰和稳定细胞株筛选已经形成一套成熟的体系。公司的成员均为硕士和博士，有着多年专业分子 生物学技术实践经验，已经成功为中科院 、北京大学等知名研究院所和多家制药企业提供技术服务 。

北京英茂盛业致力于新技术研发和改良，陆续推出了TAL合成服务、RNA体外转录 服务、蛋白包涵体复性服务、抗体制备 服务等新服务。北京英茂盛业必将以务实的科研态度，积极进取的探索精神，在新领域里取得更加丰硕的成果。

北京英茂盛业的宗旨是“提供最好的服务给客户”。在此宗旨的指引下，北京英茂盛业始终坚持业内最高的服务水平，不断提升服务质量。北京英茂盛业深知科研工作的时间宝贵，因此致力于提高效率，提供优质高效的服务。

RNAi 服务

RNA干扰(RNA interfering)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因基因功能丧失或基因表达 量的降低。因此可以作为功能基因组 学研究的一种强有力的工具。RNAi技术可以广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞新华传导通路 分析，疾病治疗等。英茂盛业采用优秀的RNA设计技术，可对靶基因RNA序列进行机构分析、干扰位点预测和序列同源性分析，设计siRNA /shRNA/miRNA 等干扰序列。经过广大客户实验证明，干扰效果稳定可靠。英茂盛业提供从siRNA 合成、RNAi载体构建到RNAi病毒包装、功能验证等全方位RNA干扰服务。

RNA干扰服务包括：

1、 RNAi载体构建

——RNAi载体表达可以长时间稳定地研究基因功能，载体在细胞中持续抑制靶基因的表达可达数周。利用抗性基因可用对应抗生素筛选出抑制靶基因表达的稳定细胞株。

1)pRI-CMV/GFP-miRNA载体构建——第二代RNA干扰载体。利用细胞内源性miRNA加工机制，比传统shRNA更高效地表达小干扰RNA前体，具有表达GFP标签可以方便地进行表达追踪和可以同时表达多个miRNA的优点。在转染 效率大于80%的前提下，英茂盛业对单个基因设计3条RNA干扰序列，可以保证至少1条可以达到干扰效率70%以上。

2)pRI-H1 shRNA干扰载体——H1启动子启动的shRNA干扰载体系列。包括带或者不带GFP荧光标签、Neomycin或Hygromycin抗性基因以及可诱导的TetOn载体可供选择。

2、RNAi转染优化

——包括siRNA导入优化和质粒 转染优化。由于siRNA和RNA干扰载体都需要转入细胞才能发挥作用。因此如何高效地将RNA干扰产品转入细胞是成功进行RNA干扰实验的关键步骤。英茂盛业有专业的siRNA和质粒 转染技术，可以对转染效率进行优化，提升RNA干扰效果。

3、RNA干扰慢病毒、腺病毒包装服务

——针对特别难转染的细胞及活体动物实验，采用慢病毒或腺病毒载体进行RNAi研究。

4、RNAi效果检测

——用实时定量PCR 或者Western blot方法在RNA水平或蛋白水平检测基因敲减效果。

5、RNAi稳定细胞株筛选

——利用抗性基因筛选RNA干扰稳定细胞株。

6、siRNA合成

——对于瞬时基因沉默实验，化学合成的siRNA具有操作方法简便，容易获得高水平的瞬时沉默效果，特异性强的优点。适合进行初步RNA干扰序列的筛选及瞬时基因敲减实验。英茂盛业设计的每条siRNA序列都经过同源性筛查，保证siRNA干扰效果的特异性。针对靶基因设计的3条siRNA序列保证其中1条的干扰效果大于70%(在转染效率大于80%)的前提下。

1)普通siRNA合成——HPLC纯化，100%去除单链RNA。

2)化学修饰siRNA——2’-Fluoro或2’-OMe提高siRNA在血清和培养基中的稳定性，作用时间长于普通siRNA。

3)荧光标记siRNA——标记后的siRNA可用于流式细胞仪 、荧光显微镜 和激光共聚焦检测，可以方便监测转染效率，优化转染条件。

1、microRNA(miRNA)干扰载体构建

~undefined第二代RNA干扰载体平台，更高干扰效率和RNA干扰片段设计成功率。

~undefined采用pRI-CMV/GFP-miRNA载体(Cat. No V6501)。载体中带有GFP荧光标签和Neomycin抗性基因。

~undefined利用细胞内源性miRNA加工机制技工出与靶基因100%同源的miRNA，对靶基因进行切割，保证大于70%基因敲减成功率。

~undefinedGFP标签与miRNA由同一启动子驱动协同表达，方便地追踪miRNA表达的实际情况。

~undefined可将多个miRNA序列串联到一起，实现对多个基因的同时干扰。

~undefinedCMV启动子可以替换为其他组织特异性启动子，与病毒感染体系配合，实现组织特异性基因敲减。

~undefined与英茂盛业病毒表达系统兼容。

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原理

pRI-CMV/GFP-miRNA载体采用CMV启动子高效表达人工设计的miRNA，后者从肠道转录本被加工，进而导致特异性的miRNA降解。

服务流程

1)针对特定基因，设计miRNA序列，合成寡核苷酸 并退火成双链DNA。

2)将DNA与pRI-CMV/GFP-miRNA载体连接，转化大肠杆菌 感受态细胞。

3)测序 验证插入miRNA片段序列无误。

4)制备质粒和菌株。

5)提交电子版测序结果报告和载体信息给客户。

客户提供

靶基因的GeneBank号。

我们提供

构建好的pRI-CMV/GFP-miRNA载体质粒和相应菌株。

质量保证

如果您订购miRNA载体构建套餐服务，在转染效率大于80%的前提下，我们保证构建的3个miRNA干扰载体中至少1个miRNA干扰载体的基因敲减效率在70%以上。

2、shRNA干扰载体构建

~undefined采用pRI系列载体H1启动子和H1 Teton启动子。

~undefined有带和不带荧光标签以及多种筛选抗性基因可供选择。

~undefined用于直接细胞转染 实验。

~undefined与英茂盛业病毒表达系统兼容。

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原理

shRNA克隆 到pRI H1载体转录为发卡结构RNA，经过Dicer剪切后形成成熟siRNA，进而导致靶基因mRNA干扰。

服务流程

1)设计shRNA序列，合成该序列 并退火生成双链DNA。

2)将DNA与pRI系列载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。

4)制备质粒和菌株。

5)提交电子版测序结果报告和载体信息给客户。

客户提供

靶基因的GeneBank号。

我们提供

构建好的pRI H1启动子载体质粒和相应菌株。

质量保证

序列测定结果符合设计要求。

3、RNAi干扰效率验证及优化服务

~undefined293细胞 干扰RNA干扰效率验证服务

~undefined客户细胞系转染条件优化，干扰效率验证服务

~undefinedsiRNA干扰效率优化

服务内容

1)293细胞干扰效率验证服务——构建好的RNA干扰质粒转染293细胞，通过荧光定量RT-PCR 或者Western-blot验证干扰效率。

2)客户细胞株转染优化和干扰效率验证服务——转染效率是RNA干扰成功的关键步骤。英茂盛业采用Genefection系列转染试剂 ，通过对转染效率优化提升RNA干扰效率。在客户细胞中验证RNA干扰效率。

3)siRNA干扰效率验证服务——采用siRNA转染试剂进行预转染实验，优化转染效率，通过荧光定量RT-PCR或者Western-blot验证干扰效率。

服务流程

1)培养细胞

2)优化转染条件：在荧光显微镜下观察转染效率或者用流式细胞检测评估转染效率。

3)根据靶基因序列设计一组RNA干扰序列。

4)采用荧光定量PCR 或Western blot评估RNA干扰效率。

5)(可选)用相应抗生素筛选稳定表达shRNA或miRNA的细胞株。

客户提供

细胞系资料和详细的细胞培养 步骤。

靶基因GeneBank编号。

抗体(如果需要Western blot检测)。

我们提供

转染效率分析优化

RNA干扰效率分析

质量保证

针对一个靶基因设计的3条siRNA可保证其中1条干扰效率大于70%(在转染效率大于80%的前提下)。

针对一个靶基因设计构建的3个miRNA干扰载体可保证其中1个干扰效率大于70%(在转染效率大于80%的前提下)。

4、慢病毒RNAi干扰服务 详见慢病毒包装服务

~undefined技术平台：第三代4质粒慢病毒表达系统;pRI-CMV/GFP-miRNA载体;pRI系列H1启动子载体。

~undefined包装为慢病毒颗粒，对分裂和非分离细胞均有感染作用。

~undefined适合用于难转染的细胞和动物RNAi研究。

~undefined稳定整合到细胞基因组，适合制备稳定基因敲减细胞株。

~undefined去除了病毒的关键蛋白，对人体安全;属于复制缺陷型病毒，不会产生下一代病毒颗粒;已被改造为自身失活性，病毒转导并整合到细胞后不再具有产生具有包装能力的病毒基因组。

原理

慢病毒属于逆转录病毒的一种，与其它逆转录病毒相比，慢病毒具有可以感染非分裂期 细胞、可以长期表达等显著优点。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体依靠转染传统转染试剂难于转染的细胞系和原代细胞，并且可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

服务流程

1)慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取。

2)转染293T细胞。

3)培养收集含有病毒上清的培养液。

4)病毒的纯化和浓缩。

5)滴度测定。

6)(可选)将病毒液转导客户的靶细胞，筛选稳定细胞株，检测靶基因表达。

客户提供

miRNA或shRNA表达质粒

所需病毒滴度和总量

我们提供

构建好的慢病毒载体质粒

已测定滴度的慢病毒

5、腺病毒RNAi干扰服务 详见腺病毒包装服务

~undefined采用复制缺陷的第二代腺病毒表达系统，安全性更高;重组 腺病毒再培养基中非常稳定。

~undefined干扰几乎所有的细胞类型，不整合到染色体 中。

~undefined能有效增殖，滴度高。腺病毒系统可产生10^8至10^9TU/ml腺病毒，浓缩后可达10^10至10^11。

原理

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的双链DNA病毒，它能感染分裂和非分裂细胞。目前采用的第二代腺病毒表达系统属于E1、E3基因缺陷型腺病毒，仅能在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制。腺病毒载体能在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因;不整合到染色体中。对于难转染的细胞如原代细胞核 非分裂细胞，采用腺病毒进行miRNA和shRNA递送是非常有效的方式。

服务流程

1)构建表达miRNA/shRNA的腺病毒载体。

2)转染293A细胞。收获细胞以制备病毒粗提液。

3)将病毒粗提液感染293A细胞扩增病毒。

4)确定病毒滴度。

5)浓缩纯化病毒。

客户提供

表达miRNA/shRNA的质粒。

所需的病毒量和滴度。

我们提供

构建好的腺病毒载体质粒

已测定滴度的腺病毒储存液

6、siRNA合成

~undefined可进行科学周到的序列设计服务，产品经过严格测试，确保质量稳定。

~undefined所有siRNA oligo均有HPLC纯化，100%去除未配对的单链。

~undefined有普通siRNA，化学修饰siRNA、荧光标记siRNA可供选择。

~undefined化学合成的siRNA具有操作简便，转染效率高，对细胞或组织毒副作用小，制备方便等特点，适用于对RNA干扰有效序列的筛选。

原理

siRNA双链结合到核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC通过同源配对定位到靶基因mRNA上，导致靶基因mRNA降解。

服务流程

设计RNA干扰序列，进行化学合成

HPLC纯化

冻干处理

客户提供

siRNA oligo的序列信息或靶基因Genebank编号(如果需要我们进行RNA干扰序列设计)。

需要的OD数，修饰要求。

我们提供

siRNA双链冻干粉。类型包括：

1、普通siRNA——HPLC纯化，100%去除未配对的单链。

2、化学修饰siRNA——利用2’-Fuoro或2’-OMe修饰以提高siRNA在血清和培养基中的稳定性，作用时间长于普通siRNA。

3、荧光标记siRNA——FAM标记siRNA，可以方便地对转染效率进行观察。

质量保证

针对靶基因设计的3条siRNA可保证其中至少1条的基因敲减效率在70%以上(在转染效率大于80%的前提下)。

更多详情见网址http://www.inovogen.com/service/RNAi/