渗透压对 CHO 细胞补料批次培养中单抗产量的影响

1 介绍

用于生产治疗性重组蛋白的哺乳动物补料批次细胞培养物的性能和产量取决于细胞对变化的培养环境的反应。

广泛报道的一种提高哺乳动物细胞生产力的策略是基于在高渗条件下培养细胞的。例如，通过加入无机或有机渗透剂（如 NaCl 或山梨糖醇）来增加渗透压。但是，细胞比生产率的提高与细胞生长的降低相结合，通常不会在产品产量方面带来整体收益。双相分批培养或逐渐增加渗透压、渗透保护成分和随后的继代培养已被成功地用于克服细胞生长抑制的问题。然而，这些研究大多数是在分批条件下进行的，高渗透压对补料批次培养的影响尚待进一步研究。

在这项工作中，我们报告了逐渐增加渗透压来增加 CHO 细胞分批培养中单克隆抗体的生产率。我们修改了 CHO 细胞补料批次操作规程，以探索渗透压逐渐升高对整体单克隆抗体生产的影响。最后高渗条件可能会影响产物糖基化，因此对补料 MAb 产品的聚糖谱进行了分析，以评估此类处理对蛋白质产品质量的影响。

2 结果与讨论

2.1 培养渗透压的逐步提高对分批补料生产率的综合影响

据报道，增加的渗透压在分批条件下会影响培养效率，因此，使用渗透压为 325、400 和 500 mOsm / kg 的培养基分批培养表达 MAb 的 CHO 细胞（图 1A 和 B）。与先前的研究一致，渗透压升高导致活细胞浓度降低和 qp 升高（图 1C 和 D），最终 MAb 浓度几乎没有总体变化。在文献中，很少有报道研究高渗透压对 CHO 补料批次培养的影响，结果各不相同。一组报告说，通过逐步增加 GS-NS0 骨髓瘤细胞补料批次培养的渗透压，提高了生产率。

为了利用增加的渗透压的效果，因此可能优选的是缓慢增加培养物的渗透压，首先允许较高的细胞生长速率（在较低的渗透压水平下），然后随着渗透压的增加，在培养的后期增加 qp。在 CHO-MAb 分批补料培养的情况下，使用 5 倍浓缩氨基酸进料（``Hi'' 渗透法）会导致培养物的渗透压逐渐从 320 mOsm / kg 升高到约 420 mOsm / kg（图 2）与保持低渗透压（降至 280 mOsm / kg）的 1x 补料添加培养物（'Lo' 渗透状态）相比。

图 1. 渗透压对批次 MAb-CHO 培养的影响。
（A）C44 和（B）C56 细胞系在不同分批培养渗透压下的活细胞浓度（VCC）与时间的关系。（C）qp 和（D）C44 和 C56 的最终 MAb 浓度和总 MAb 与培养物渗透压的函数关系。 所有数据均取两次重复分析的平均值。

图 2. 在高（Hi-EN / CYD 5x）和低（Lo-EN / CYD 1x）渗透压方案下，C44 的渗透压分布图。

总体而言，逐渐增加培养物的渗透压可以提高 MAb-CHO 培养物的生产力，高渗透压对低产克隆（C44）的有效性最大，可能是高产克隆（C56）的生产力接近其在这些补料批次条件下的生产能力。使用表达人-骆驼嵌合抗体的另一种 CHO 细胞系（基于 CHO-DUKXB 的 CHO-EG2），测试了使用浓缩的 5x 氨基酸补料逐渐增加补料批次培养物渗透压的效果，并证实了重组蛋白的总产量从 3.0 毫克增加到 5.4 毫克，而 qp 从 1.2 增加到 2.7 pg /细胞/天（见图 3）。渗透作用对生产率的作用机理尚不清楚，尽管这种作用先前已被指出。

图 3. 渗透压的逐渐增加对 CHO-EG2（人-美洲驼嵌合抗体）生产力的影响。
（A）活细胞浓度与时间的关系，（B）在高渗透压（Hi-EN / CYD 5x）和低渗透压（Lo-EN / CYD 1x）下分批补料培养的总 EG2 和（C）qp。 所有数据均取两次重复分析的平均值。

2.2 培养物渗透压的逐步升高对 MAb 糖基化模式的影响

提高 MAb 生产率是可取的，但前提是必须保持 MAb 的产品质量（例如糖基化）。先前已有报道，高渗透压可能影响重组蛋白的糖基化模式，从而潜在地影响蛋白质的稳定性，效力，吸收或清除率，从而损害治疗性效力和法规遵从性。图 4 和表 1 显示了在高渗透压或低渗透压下，从分批补料培养结束后获得的几个样品的 HPLC 聚糖谱。岩藻糖基化，唾液酸化，半乳糖基化和触角指数指示每个聚糖结构中岩藻糖，唾液酸，半乳糖和 GlcNAc 残基的出现比例。结果表明，改变补料批次条件对糖基化指数影响很小。大多数重链聚糖谱在不同的渗透压下相对稳定，尤其是对于 C56 细胞培养物中产生的 MAb。结果与文献中描述的重链抗体糖基化的性质兼容，即大量的非半乳糖基化岩藻糖基化聚糖结构（G0F），然后是具有一个（G1F）或两个（G2F）半乳糖残基的岩藻糖基化结构，具有有限的高甘露糖结构和唾液酸化的缺乏。总的来说，聚糖谱显示在高渗条件补料批次操作下基本上不影响 MAb 产物的糖基化。

表 1 使用 HPLC 分析从 MAb 重链释放的聚糖

注：其中 A＝N-乙酰氨基葡糖，F＝岩藻糖，G＝半乳糖，M＝甘露糖，S＝唾液酸，GU＝葡萄糖单位。

图 4. 在 3 -MA 处理和不同渗透压下分批补料的 C44 和 C56 培养物中产生的 MAb 重链的 HPLC 聚糖谱。

3 结论

在这项研究中，研究了逐渐增加渗透压的影响。这项研究通过证明发现逐渐增加补料批次培养物的渗透压，可以通过在培养后期增加 qp 之前使细胞生长至高密度来使 MAb 产量增加一倍。对于表达嵌合抗体的 CHO-DUKXB 细胞系，逐渐增加分批补料培养物的渗透压浓度也使蛋白质的产量增加了两倍。

最后，表明高渗透压不会显着影响聚糖谱，这对于临床蛋白质的生产来说是一个重要结果。逐渐增加培养物的渗透压有望为提高工业补料批次生产率提供更实际的选择。

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Increased CHO cell fed-batch monoclonal antibody production using the autophagy inhibitor 3 -MA or gradually increasing osmolality, S. Soroush Nasseri, Navid Ghaffari, Katrin Braasch, et al., Biochemical Engineering Journal 91 (2014) 37–45

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