分子筛，你今天保养了吗
Cytiva（思拓凡）
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分子筛（SEC）无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。要想获得满意的实验结果，一个高分辨高性能的柱子是必不可少的。刚接触层析的小伙伴们，接过这娇贵的柱子，是否不觉有种心跳加速，无从下手的感觉？这么娇贵的柱子，要怎么维护？不用担心，让我们一起了解学习一下吧~
首次使用建议：
在连接层析柱前，请务必务必务必确认流路中没有空气！一般柱子都是保存在20%乙醇溶液中，以避免微生物的繁殖，但是20%乙醇的粘度高于水溶液，因此，需要降低流速以避免柱床被压缩。
总结一下：
将柱子连接至系统，并确保连接时柱子前端的流路中没有气泡；
使用缓冲液置换柱子内的酒精时，请使用低流速；
如果需要，请测试柱子的耐压参数（increase系列）；
刚才我们也提到了柱效测定，这是一个什么参数？我们应该怎么做呢？
测柱效是一个快速检测柱子与仪器性能的方法。或许你会问，我们一直在说柱子，为什么会提到了仪器？其实仪器管道的粗细、死体积的大小都会对柱效的结果有所影响，因此，评价一根柱子性能的变化，需要在相同的仪器相同的实验条件下进行。一般我们可以采用1%体积的1%丙酮在280nm吸收检测，具体的操作在每根柱子的说明书中有详细的介绍。另外ÄKTA仪器也能通过峰积分快速计算得到结果。
实验过程中，哪些地方需要我们关注的呢？
1. 低温下操作：为了保护蛋白的稳定性，很多小伙伴们都会选择在低温下进行层析。那么必须提醒一下，溶液在低温时，粘稠度会增加，所以一定要降低流速。除此之外，还需要注意的是，请确保所有溶液与柱子的温度保持一致，以避免因为温度的改变而引入气泡。
2. 样品制备：好的样品是实验成功的第一步。对于分子筛，所有的样品必须通过0.22μm滤膜过滤（或者10,000g离心10分钟取上清）避免颗粒物堵塞柱子。另外，需要确保实验过程中，pH、温度等条件下，样品不会变性或聚集沉淀。如果需要使用助溶的试剂（例如去污剂），请确保实验过程中的样品、溶液中同时添加。
3. 缓冲溶液：分子筛属于非吸附式层析，只需要一种缓冲溶液，具有非常好的兼容性，基本上我们只需要考虑蛋白的稳定性来选择合适的缓冲液。一般我们在实验中会加入150-300mM的NaCl，以降低非特异的吸附。使用不同的溶液的时候，因为溶液本身粘稠度的不同，请适当降低流速以保护柱子。
4. 常规清洗：定期的清洗能够延长柱子的使用寿命，维持好的分辨率。清洗的频率与样品和对分辨率的要求等实际情况相关。通常，如果发现柱子顶端有颜色的改变，或者柱子的背压增高，分辨率下降等，那就提示我们需要及时对柱子进行清洗了。对于Superdex和Superose系列的柱子，一般都建议反向的清洗，Hiprep Sephacryl系列柱子则一般采用正向清洗。最常规的清洗方式是采用1个柱体积的0.5M NaOH（Superdex 和Superose系列）或者0.2M NaOH（Sephacryl系列），并马上用2个柱体积的水和2个柱体积的缓冲液平衡，切勿长时间的将柱子保存在NaOH溶液中。
如果常规清洗仍无法达到理想的效果，可以根据残留物的不同选择其它的清洗方式：例如：0.5M 醋酸溶液，1M NaOH，8M尿素或者6M 盐酸胍（针对蛋白沉淀），30%异丙醇（对于脂类或者疏水物质），再者还可以考虑使用胃蛋白酶（1mg/ml溶于0.1M醋酸、0.5MNaCl中）消化，再使用NaOH清洗。
5. 保存：如果超过2天不使用层析柱，建议使用2倍柱体积的水冲洗柱子后再使用2倍柱体积的20%乙醇冲洗柱子保存。（Hiload Superdex 30pg与Hiload Superdex 75pg建议在20%乙醇中加入0.2M NaAc，以保持pH的稳定）。再次强调，20%乙醇的粘度比较高，请注意降低流速。如果长期保存或者需要运输，请链接保护装置以避免因为环境的改变而引入的气泡。
其实，分子筛的使用并不复杂，只要胆大心细，认真耐心，一定能获得好的实验结果~
首次使用建议：
在连接层析柱前，请务必务必务必确认流路中没有空气！一般柱子都是保存在20%乙醇溶液中，以避免微生物的繁殖，但是20%乙醇的粘度高于水溶液，因此，需要降低流速以避免柱床被压缩。
总结一下：
将柱子连接至系统，并确保连接时柱子前端的流路中没有气泡；
您的层析柱已经准备就绪。
刚才我们也提到了柱效测定，这是一个什么参数？我们应该怎么做呢？
测柱效是一个快速检测柱子与仪器性能的方法。或许你会问，我们一直在说柱子，为什么会提到了仪器？其实仪器管道的粗细、死体积的大小都会对柱效的结果有所影响，因此，评价一根柱子性能的变化，需要在相同的仪器相同的实验条件下进行。一般我们可以采用1%体积的1%丙酮在280nm吸收检测，具体的操作在每根柱子的说明书中有详细的介绍。另外ÄKTA仪器也能通过峰积分快速计算得到结果。
实验过程中，哪些地方需要我们关注的呢？
1. 低温下操作：为了保护蛋白的稳定性，很多小伙伴们都会选择在低温下进行层析。那么必须提醒一下，溶液在低温时，粘稠度会增加，所以一定要降低流速。除此之外，还需要注意的是，请确保所有溶液与柱子的温度保持一致，以避免因为温度的改变而引入气泡。
2. 样品制备：好的样品是实验成功的第一步。对于分子筛，所有的样品必须通过0.22μm滤膜过滤（或者10,000g离心10分钟取上清）避免颗粒物堵塞柱子。另外，需要确保实验过程中，pH、温度等条件下，样品不会变性或聚集沉淀。如果需要使用助溶的试剂（例如去污剂），请确保实验过程中的样品、溶液中同时添加。
3. 缓冲溶液：分子筛属于非吸附式层析，只需要一种缓冲溶液，具有非常好的兼容性，基本上我们只需要考虑蛋白的稳定性来选择合适的缓冲液。一般我们在实验中会加入150-300mM的NaCl，以降低非特异的吸附。使用不同的溶液的时候，因为溶液本身粘稠度的不同，请适当降低流速以保护柱子。
4. 常规清洗：定期的清洗能够延长柱子的使用寿命，维持好的分辨率。清洗的频率与样品和对分辨率的要求等实际情况相关。通常，如果发现柱子顶端有颜色的改变，或者柱子的背压增高，分辨率下降等，那就提示我们需要及时对柱子进行清洗了。对于Superdex和Superose系列的柱子，一般都建议反向的清洗，Hiprep Sephacryl系列柱子则一般采用正向清洗。最常规的清洗方式是采用1个柱体积的0.5M NaOH（Superdex 和Superose系列）或者0.2M NaOH（Sephacryl系列），并马上用2个柱体积的水和2个柱体积的缓冲液平衡，切勿长时间的将柱子保存在NaOH溶液中。
如果常规清洗仍无法达到理想的效果，可以根据残留物的不同选择其它的清洗方式：例如：0.5M 醋酸溶液，1M NaOH，8M尿素或者6M 盐酸胍（针对蛋白沉淀），30%异丙醇（对于脂类或者疏水物质），再者还可以考虑使用胃蛋白酶（1mg/ml溶于0.1M醋酸、0.5MNaCl中）消化，再使用NaOH清洗。
5. 保存：如果超过2天不使用层析柱，建议使用2倍柱体积的水冲洗柱子后再使用2倍柱体积的20%乙醇冲洗柱子保存。（Hiload Superdex 30pg与Hiload Superdex 75pg建议在20%乙醇中加入0.2M NaAc，以保持pH的稳定）。再次强调，20%乙醇的粘度比较高，请注意降低流速。如果长期保存或者需要运输，请链接保护装置以避免因为环境的改变而引入的气泡。
其实，分子筛的使用并不复杂，只要胆大心细，认真耐心，一定能获得好的实验结果~
