讲座2PCR技术的发展

聚合酶链反应的历史回顾
聚合酶链反应相关技术的发展
其它体外核酸扩增技术
PCR技术的应用举例



一、聚合酶链反应的历史回顾

1、核酸体外扩增最早的设想

　　由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。

2、聚合酶链反应的发明

　　直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。

二、聚合酶链反应相关技术的发展

　　PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。

(表)聚合酶链反应的相关技术

名　　　称
主要用途

简并引物扩增法
扩增未知基因片段

巢居PCR
提高PCR敏感性、特异性，分析突变

复合PCR
同时检测多个突变或病原

反向PCR
扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变

单一特异引物PCR
扩增未知基因组DNA

单侧引物PCR
通过已知序列扩增未知cDNA

锚定PCR
分析具备不同末端的序列

增效PCR
减少引物二聚体，提高PCR特异性

固着PCR
有利于产物的分离

膜结合PCR
去除污染的杂质或PCR产物残留

表达盒PCR
产生合成或突变蛋白质的DNA片段

连接介导PCR
DNA甲基化分析、突变和克隆等

RACE-PCR
扩增cDNA末端

定量PCR
定量mRNA或染色体基因

原位PCR
研究表达基因的细胞比例等

臆断PCR
鉴定细菌或遗传作用

通用引物PCR
扩增相关基因或检测相关病原

信使扩增表型分型(mapping)
同时分析少量细胞的mRNA


三、其它扩增技术

　　与PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与PCR互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信，随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。

其它体外核酸扩增技术(表)

技术
应用

转录依赖的扩增系统(TAS)
检测HIV

连接酶链反应(LCR)
检测点突变

自主序列复制(3SR)系统
研究RNA，临床应用、法医学等

链替代扩增(SDA)
检测、鉴定基因

Qβ复制酶系统
增加探针检测敏感性

循环探针反应
增加探针检测敏感性


连接酶链反应 (A)

　　连接酶链反应(Ligase　chain　reaction，LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman　1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明，并申报了专利。

　　LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。

　　LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性 和65℃复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多 态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。

依赖核酸序列的扩增 (A)

　　依赖核酸序列的扩增(Nucleic　acid　sequence-based　amplification,NASBA) ，又称自主序列复制系统(self-sustained　sequence　replication，3SR)或再生长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。

　　NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。　

　　其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA分子二级结构打 开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNase　H,并在37℃反应1～1.5小时,其 产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。

　　NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。　

转录依赖的扩增系统 (A)

　　转录依赖的扩增系统(Transcript-based　amplification　sytem，TAS)，是 Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。

　　TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行 6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。

　　虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶，有待进一步研究。

Qβ复制酶反应 (A)

　　Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶(Q-beta　replicase)催化RNA模板的自我 复制功能，它能在常温30min，将其天然模板MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经洗脱未被结合 的MDV-1后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。

　　Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：①不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。②能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有 的RNA折叠结构。③在Q　β复制酶的天然模板MDV-1　RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。　因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Q　β复制酶扩增。　

　　1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1质粒里，用T7　RNA聚合酶催化转录 出MDV-1　RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。

四、PCR技术的应用举例：

　　研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆 或表达载体；检测某基因的内切酶多态性

　　诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致 病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等)；病毒(HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19)；寄生虫(疟疾 等)；人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)

　　免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋 巴因子定量

　　人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱

　　法医：犯罪现场标本分析；HLA-DQ

　　肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤

　　组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗 传学。

　　古生物学：考古与博物馆标本分析

　　动物学：动物传染病的诊断等

　　植物学：检测植物病原等