基于病毒载体的不同基因调控方式的原理和选择

1. 病毒载体可以进行哪些方面的基因操作？

基因功能研究主要涉及功能获得和功能缺失，功能获得主要包括外源的过表达，内源性激活，功能缺失主要包括基因干扰和敲除等。借助病毒载体可以进行基因过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作，其中基因包括编码基因和非编码基因。

2 不同基因调控方式的原理

基因功能研究中通常需要上调目的基因的表达来观察表型的变化。过表达是将目的基因在宿主细胞大量表达的过程，其基本原理是将目的基因构建到工具载体上，导入细胞使基因实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。

使用病毒载体进行基因的过表达操作是一项成熟的技术，研究者仅需根据实验需求选择合适的启动子、荧光、标签和抗性构建合适的载体，包装成病毒，感染细胞，即可实现基因过表达操作。
注：进行基因过表达前，首先需要对目的细胞进行本底表达检测，本底表达低，可以进行过表达操作，如果本底表达过高则考虑换同种其它细胞或进行基因干扰操作。

RNA干扰(RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。

外源dsRNA 进入细胞后产生的小分子干扰RNA（siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。

注：进行基因干扰前，首先需要对目的细胞进行本底表达检测，本底表达高，可以进行干扰操作，如果本底表达较低，则考虑换同种其它细胞或进行基因过表达操作。

CRISPR/Cas9是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术，其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA（gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，造成DNA双链断裂，细胞利用非同源末端连接(NHEJ）或者同源重组（HR）方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。

在基因敲除中，Cas9蛋白会在gRNA的引导下，对特定DNA位点进行切割产生双链断裂，随后细胞通过非同源末端连接方式修复DNA，在此过程中，将随机引起碱基的缺失或增加，基因发生移码突变，导致编码基因的敲除。
注：对于一些基因表达的蛋白功能比较强的情况下，干扰不足以产生表型的时候，可考虑借助CRISPR/Cas9技术，进行基因组水平的敲除进行基因的功能研究。

通过人为突变Cas9的RuvC1、HNH两个剪切位点，Cas9蛋白的切割能力损失变成dCas9蛋白，dCas9和sgRNA复合物可以在DNA的特定位置结合在DNA上，在此基础上，研究人员在复合物的后方连接一些转录调控元件，如转录激活的VP64、VP16等，转录抑制的KRAB等，同时将复合物锚定在基因转录起始区域的上游，即可实现对特定基因的转录激活或转录抑制。