Visium FFPE 的风很大，你真的了解吗？

2020年夏天，空间转录组技术（Visium）横空出世，空间转录组技术将组织学影像与RNA测序的高通量和发现能力相结合，对样本进行全转录组（WTA）分析，获得基因在空间位置上的表达信息，但初代Visium技术实验只能用冰冻组织样本，时隔一年该技术已经适用于石蜡包埋组织样本，今天咱就来唠唠，看着风很大的Visium FFPE 空间转录组到底是什么，和之前的Visium冰冻组织样本(以下称visium）区别在哪？

什么是FFPE

FFPE（石蜡包埋）样本是目前绝大多数科研人员和临床医生首选的长期保存样本的方法，该方法可将珍贵样本保存几年甚至10年以上，且大多样本通常有对应的临床匹配追踪数据，若能再结合高通量测序数据，对疾病研究和治疗来说都有非常大的意义。

但也因珍贵样本保存时间长，FFPE组织内存在RNA/DNA降解的情况，片段化的RNA用oligoT探针捕获会丢失很多信息。历经一年时间，空间转录组技术已针对FFPE样本提出了解决方案，不在局限于冰冻组织切片，石蜡样本也可以通过空间转录组技术获取基因表达和空间定位的全部转录组信息，区分和定位功能基因在特定组织区域内的活跃表达情况。



Visium和Visium FFPE原理比较

Visium是将组织切片固定、透化，释放细胞中的mRNA直接与带有RNA结合捕获探针的载玻片结合，再将mRNA合成cDNA并制备测序文库进行上机测序，从而获取基因表达信息，因其对polyA尾的探针捕获设计，Visium对实验样本针对真核生物，物种没有明确限制。

在Visium FFPE组织中，样本切片需先和预设的探针（probe）杂交，进一步完成连接反应，再透化释放连接probe与载玻片上的探针结合，从而捕获基因表达信息，Visium FFPE目前只针对人（1.8万个gene）和小鼠（2万个gene)的基因数据库设计探针，用RNA模板连接（RTL），将特异针对蛋白编码转录组中基因的探针对与其基因靶点杂交，然后彼此连接。对组织进行透化处理，以释放连接的探针对，使其与玻片上的捕获探针杂交，从而实现基因表达信息的捕获。



具体来说，针对FFPE样本RNA降解的特殊性，Visium FFPE针对每一个基因（人和小鼠），都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列，LHS（左端探针）带有read2序列，用以后续PCR扩增，RHS（右端探针）带有polyA序列，用以后续被玻片探针捕获结合,通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链形，透化释放连接probe，完成信息捕获过程。



而在玻片探针设计方面，Visium FFPE也延续了Visium的强大实力，每个捕获区域大小为6.5mm X 6.5mm，含有4992个被条形码标记的点（barcoded spots），每个spot直径55μm，spot与spot中心点之间的距离为100μm，每个spot含有上亿个可以与mRNA结合的捕获探针，每个探针上都带有独特的spatial barcodes，用以标记捕获的mRNA的空间位置。



Visium FFPE的特色

1. 采用RNA模板连接（RTL）探针组来确保高灵敏度和高特异性
2. 对存档样本重新利用，挖掘新的生物标记物
3. 进行回顾性研究和纵向研究，全面了解疾病复杂性
4. 结合免疫荧光实现蛋白质与RNA的共检测或与H&E染色相结合来观察形态背景

空间转录组测序整体实验流程

对新鲜冷冻组织或FFPE组织进行切片，并将其放置在文库制备玻片上，然后进行固定，通过H&E或免疫荧光（IF）染色并成像，接着添加空间条形码并构建文库。对制备好的文库进行测序，获得后续数据分析的原始数据。