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PCR实验中DNA聚合酶的选择及实验方法

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8009

一、 DNA聚合酶的选择

实验室常用 DNA聚合酶有三种:TaKaRa TaqTM,TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTMDNA Polymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA 聚合酶,保真性较差,但价钱便宜,一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐热性 DNA聚合酶,具有一定的保真性,而且其扩增得到的PCR产物 3’端附有一个 “A ”碱基,如果希望直接将产物克隆 到 T -vector可以用此酶。

PyrobestTMDNA Polymerase 也是具有Proof reading 活性的耐热性DNA 聚合酶,其特点是保真性极高,扩增得到的 PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增 请使用此酶。

二、按下列组成在PCR 反应管中调制反应液

TaKaRaTaqTM或TaKaRaE XTaqTM的配方
Reagent Quantity,for 50µ l of reactionmixture
10X PCR buffer (Mg2+free) 5 µl
MgCl2(25mM) 如 TaKaRaTaqTM加 3 µl
如 TaKaRaEXTaqTM加 4 µl
2.5mMdNTP mix 4 µl
10µ M Primer 上游 1 µl
10µ M Primer 下游 1 µl
TemplateDNA 1 µl
Taq或E XTaqDNAPolymerase 0.25 µl
Steriledeionizedwater Up to 50µl
Total 50 µ l /Sample

Reagent Quantity,for 50µ l of reactionmixture

PyrobestTMDNA Polymerase的配方
10X Pyrobestbuffer 5µl
2.5mMdNTP mix 4µl
10µ M Primer 上游 1µl
10µ M Primer 下游 1µl
TemplateDNA 1µl
PyrobestTMDNA Polymerase 0.25µl
Steriledeionizedwater Up to 50µ l
Total 50µ l /Sample


①反应总体积根据实际情况进行调控,可以做 20~50µ l以节约试剂;

②将上表各成分加入到 0.2ml或 0.5ml灭菌的 PCR薄壁管中;

如果不用 PCR仪的加热盖,在反应混合液的上层加 30 ~ 50µ l的矿物油 防止样品在 PCR的过程中蒸发;

三、按以下程序进行PCR 扩增

PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异,在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR结果而进行优化。

Step Temperature,° C Time,min Number of cycles Note
起始变性 94~95 1~3 1
变性 94~95 0.5~2 25~35 退火温度比理论退火温度大概低 5°C,再根据反应结果优化
退火 37-70 0.5~2
延伸 70-75 根据扩增产物的大小 每分钟延伸 1000bp
最终延伸 70-75 10 1


反应结束后,抽取扩增样品 5µ l,用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存,以备以后分析使用

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