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糖尿病动物模型的建立

丁香实验

2151

糖尿病(diabetes mellitus ,DM)已成为严重危害人类健康的公共卫生问题。DM 及其并发症不仅严重影响糖尿病患者的生活质量,同时也是致残、致死的重要原因。因此,建立合适的糖尿病动物模型,阐明 DM 及其并发症的发病机制就显得尤为重要。目前,DM 动物模型制备方法主要有:手术切除胰腺、化学药物诱导、自发性糖尿病动物模型、转基因动物等。

一、切除胰腺的 DM 模型

常采用狗、猫和大鼠等造模,全部或大部分切除实验动物的胰腺,但保存胰十二指肠动脉吻合弓。如果连续两天血糖值超过 11.1mmol/L或者葡萄糖耐量试验 120min 时的血糖值仍未恢复到注射前水平则认为 DM 造模成功。其机制是全部或大部分切除胰腺后,β细胞缺失而产生永久性 DM。

二、化学药物诱发的 DM 模型

采用链脲佐菌素腹腔注射或四氧嘧啶静脉注射可诱发 DM,常用动物有小鼠、大鼠、家兔和狗。链脲佐菌素(streptozotocin STZ)的参考剂量为 50~150mg/kg;四氧嘧啶(alloxan)的参考剂量为 60~110mg/kg。

STZ 是一种含亚硝基的化合物,进入体内可通过以下机制特异性地破坏胰岛β 细胞:

(1)STZ 直接破坏胰岛β细胞:主要见于注射大剂量 STZ 后。STZ 注射后可引起 β 细胞内辅酶I(NAD)的浓度下降,NAD 依赖性能量和蛋白质代谢停止,导致 β 细胞死亡;

(2)通过诱导一氧化氮(NO)的合成,破坏胰岛 β 细胞;

(3)STZ 激活自身免疫过程,进一步导致β细胞的损害:小剂量注射 STZ 可破坏少量胰岛 β 细胞,死亡的胰岛β细胞可作为抗原被巨噬细胞吞噬,产生 TH1 刺激因子,使TH1细胞系占优势而产生 IL-2 及 IFN-γ,在胰岛局部促使炎性细胞浸润,并活化释放 IL-1、TNF-α、IFN-γ、NO 和 H2O2 等物质杀伤细胞。死亡细胞又可作为自身抗原,再次递呈给抗原递呈细胞进行处理,释放细胞因子,放大细胞损伤效应,最终诱发 DM。

四氧嘧啶进入体内后能迅速被胰岛 β 细胞摄取,影响细胞膜的通透性和细胞内 ATP 的产生,抑制葡萄糖介导的胰岛素分泌。四氧嘧啶主要通过产生氧自由基破坏 β 细胞结构,导致细胞的损伤及坏死,从而阻碍胰岛素的分泌,使血清胰岛素水平降低。因为四氧嘧啶导致糖尿病的同时也造成肝、肾组织中毒性损害并且部分采用四氧嘧啶制造的 DM 动物模型可自发缓解,因此目前已经很少应用。

三、自发性糖尿病动物模型

该模型绝大多数采用有自发性 DM 倾向的近交系纯种动物,如 BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠、G(Goto-kakisaki)鼠和中国地鼠(chinese hamster)等动物造模。自发性 DM 动物模型是指动物未经过任何有意识的人工处置,在自然情况下发生 DM 的动物模型。已用于研究的自发性 DM 动物约有 20 种,可分为两类:

一类为缺乏胰岛素,起病快、症状明显,并伴有酮症酸中毒,如 BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠和 LETL 大鼠,它们可以作为 1 型 DM 的动物模型使用。这些动物没有肥胖,发病之初呈现胰腺炎的症状,人类组织相关性抗原(MHC)参与发病过程,这些都与人 1 型 DM 的特征相似。利用这些模型可以对人 1 型 DM 的发病机制进行深入研究;

另一类为胰岛素抵抗性高血糖症,其特点是病程长,不发生酮症酸中毒,为 2 型 DM 动物模型。常用的 2 型 DM 自发性动物模型有中国地鼠(Chinese hamster)、GK(Goto-Kakisaki Wistar rats)大鼠、NSY (Nagoya-Shibata-Yasuda) 鼠和 OLETF 大鼠。

(一)1 型糖尿病动物模型

1、BB 大鼠

BB 鼠是常用的1型DM模型动物,是由加拿大渥太华 Biobreeding 实验室培育而成。大约 50%~80% BB 鼠可发生 DM,雄性与雌性大鼠发病率相当。BB 大鼠一般于 60~120 日龄时发生 DM,发病前数天可见糖耐量异常及胰岛炎。

发病的大鼠具有1型DM的典型特征:体重减轻、多饮、多尿、糖尿、酮症酸中毒、高血糖、低胰岛素、胰岛炎、胰岛 β 细胞减少,需依赖于胰岛素治疗才能生存。

BB 大鼠另一个特点是其血液中淋巴细胞减少,易于感染。此外,BB 大鼠发生淋巴细胞甲状腺炎的频率较高,其血清常可检测出抗平滑肌、骨骼肌、抗壁细胞和抗甲状腺球蛋白的自身抗体

2、NOD 小鼠

NOD 小鼠为一种自发性非肥胖 DM 小鼠,其发病年龄和发病率有着较为明显的性别差异,雌鼠发病年龄较雄鼠明显提早,发病率亦远高于雄鼠,NOD 小鼠 3-5 周龄时开始出现胰岛炎,浸润胰岛的淋巴细胞常为 CD4+或 CD8+淋巴细胞,于 13~30 周龄时发生明显 DM。

与 BB 大鼠不同的是,NOD 小鼠一般不出现酮症酸中毒,无外周血淋巴细胞减少,但同样需要胰岛素治疗以维持生存。

在 NOD 鼠胰岛炎初期,血浆和胰岛灌注液中胰岛素的基础值和对葡萄糖的反应值均减低,同时胰高血糖素和胰高血糖素样物质的免疫活性增加,NOD 小鼠葡萄糖激酶、丙酮酸激酶等活性下降,葡萄糖- 6 -磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶的活性增加,肝组织中转氨酶、乳酸脱氢酶、支链氨基酸以及肾脏组织中的 β-N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶、α- 葡萄糖苷酶和 α- 甘露糖苷酶等活性也均降低。

NOD 小鼠伴发 DM 是遗传、免疫和自由基损伤多因素综合作用的结果,NOD小鼠这些特点与1型DM患者相似,是研究关于 1 型 DM 遗传学、免疫学、病毒学特征及其预防和治疗等方面的良好动物模型。

3、 LETL(long evans tukushima lean)大鼠

LETL 也是一种 1 型 DM 模型的动物,通常于 8~20 周龄时发生 DM,雄性大鼠发病率约为 21%,雌性大鼠发病率约为 15%,如果在 5~7 周龄时使用环磷酰胺处理大鼠则其在 16 周龄时,DM 发病率增加一倍。LETL 大鼠无外周血淋巴细胞减少,在明显 DM 症状发生前 4~5 天,胰岛可见有明显的淋巴细胞浸润。

(二)2 型糖尿病动物模型

1、嗜沙肥鼠(Psammonys Obesus,PO) 

PO 大鼠是生活在沙漠地区的啮齿类动物,该鼠具有明显的胰岛素抵抗,在高热量饮食条件下(数天~两周),90% 的 PO 大鼠可自发出现高胰岛素血症,并伴有明显的高血糖,随后出现胰岛素水平降低。PO 大鼠的 DM 发病大致可分为以下四个阶段:

①起始阶段:该阶段内血糖及血清胰岛素水平均正常;

②高胰岛素血症期:该期血糖仍保持正常,但血清胰岛素明显升高;

③高胰岛素和高血糖期:该期内血糖>11.1mmol/L;

④低胰岛素高血糖期:该期由于胰岛 β 细胞分泌功能损害导致低胰岛素和高血糖,大鼠需应用胰岛素治疗以维持生存。Duhault 等发现 PO 大鼠在 2 型DM 晚期呈胰岛素依赖性,胰腺组织学显示有胰岛炎存在,说明其具有迟发1型 DM(Latent autoimmune diabetes mellitus in adult,LADA)的特点,故 PO 大鼠可能适用于 LADA 的研究。

2、中国地鼠

自发性 DM 地鼠模型是将健康的中国地鼠通过近亲繁殖而获得。这种模型以轻、中度高血糖为特征,动物为非肥胖型,血清胰岛素表现多样,胰岛病变程度不一,类似于人类的 2 型 DM。多数地鼠 DM 发病在 1 岁龄以内,群体发病率约为 20.88%。

3、GK大鼠(Goto-Kakisaki Wistar Rats)

GK 大鼠是一个常用的自发性非肥胖 2 型 DM 模型动物,GK 雌、雄鼠发病率相当,一般于 3~4 周龄时发生明显的 DM。在高血糖发生前,常有一段血糖正常时期(从出生后到断奶),相当于人类的 DM 前期。其特征有:

葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损,β 细胞数目减少 60%,肝脏对胰岛素的敏感性降低,导致肝糖生成过多;

肌肉和脂肪组织呈中度胰岛素抵抗。GK 大鼠血压也较正常 wistar 大鼠高(低盐摄入约高 15 mmHg,高盐摄入约高 24 mmHg)。

此外,GK 大鼠具有与人类 2 型 DM 微血管并发症相似的改变如运动神经传导速率减慢、神经纤维有节段性脱髓鞘、轴突变性、视网膜血管内皮生长因子(VEGF)表达增加、视网膜局部血流减少、白蛋白尿、肾小球基底膜增厚、肾小球肥大和硬化等。

4 、Zucker DM 肥胖(zucker diabetic fatty,ZDF )大鼠

ZDF 大鼠是常用的 2 型 DM 模型动物,该鼠由于瘦素受体突变导致多食、肥胖同时伴有高胰岛素血症、高脂血症和中度高血压。

雄性 ZDF 大鼠一般于 8~10 周出现 DM,有 DM 的典型症状如多饮、多尿和体重增加缓慢,并可出现神经病变。

雄性 ZDF 大鼠肌肉 GLUT4 表达明显降低,其胰岛 β 细胞 GLUT2 表达也明显下调,这可能是 ZDF 大鼠发生2型糖尿病的机制。组织学研究发现,6 周龄大鼠胰岛即表现有结构紊乱和纤维化、胰岛 β 细胞脱颗粒现象,同时胰岛 β 细胞数量远低于相同周龄的非 DM ZDF 大鼠。

5 、NSY(Nagoya-Shibata-Yasuda)小鼠

NSY 小鼠是从 jcl ICR 远交系小鼠根据葡萄糖耐量选择繁殖产生的,具有年龄依赖性自发发生 DM 的特征。该鼠在任何年龄都无严重的肥胖,也无很高水平的高胰岛素血症,但在第 24 周龄出现显著的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能的减弱。病理学上未见胰岛增生或炎性改变等形态学异常,提示 NSY 小鼠发生 2 型 DM 的原因可能是胰岛 β 细胞对葡萄糖诱发的胰岛素分泌功能改变。胰岛素抵抗可能在其发病机理中发挥一定的作用。NSY 小鼠将有助于人们对 2 型 DM 遗传学倾向及病理发生的进一步研究。

6、 OLETF(Ostuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠

OLETF 大鼠是河野等利用 Long-Evans 系大鼠建立的自发性 2 型 DM 模型动物。该鼠由于胆囊收缩素 (CCK)-A 受体 mRNA 的表达完全缺失,导致其食欲亢进和肥胖,消化道对 CCK-8 刺激无反应,胰腺的内、外分泌功能均降低。此模型具有 2 型 DM 的特征如多食、肥胖、多饮和多尿,能缓慢地自然产生 2 型 DM。OLETF 大鼠自 8 周龄起血清甘油三酯、胆固醇和餐后血糖均明显高于对照鼠,随着年龄的增长,血清甘油三酯和餐后血糖不断升高。

12 周龄起出现明显的胰岛素抵抗;18 周龄时,胰岛素敏感性约为对照组的20%;24 周龄时,血浆胰岛素代偿性增加;30 周龄时,血 TG 水平达到对照组的5倍;40 周龄以后,胰岛的分泌功能降低;65 周以后,血糖值高达25mmol/L,而免疫反应性胰岛素(IRI)水平却低于 40 pmol/L。OLETF 大鼠尿蛋白自 30 周龄起明显增多,且随年龄的增加而迅速增加,雄性鼠 55 周龄时,尿蛋白含量可达 800mg/d 以上。

组织学研究发现,OLETF 大鼠胰腺呈进行性纤维化。20 周龄时,胰腺即有明显的纤维化、胰岛增大;40 周龄时,胰岛被结缔组织取代;70 周龄时,胰腺极度萎缩,胰腺组织被脂肪和结缔组织代替。

此外,OLETF 大鼠在 22 周龄时,即可出现肾小球基底膜增厚;40 周龄以后,雄 性OLETF 大鼠肾小球增大,肾小球膜基质增生及肾小球基底膜增厚;70周龄时,几乎在每一个肾小球周围都可见被扩张的毛细血管包围的PAS-阳性结节,这种结节性的改变膨胀到肾小球膜基质,OLETF 大鼠的肾脏变化很类似人的 DM 结节性肾小球硬化症。以上胰腺和肾脏不同阶段的病理变化,与临床 2 型 DM 患者的病理表现极为相似,为研究 2 型 DM 及其并发症的发病机制和胰岛素抵抗干预措施的评价提供了良好的实验动物模型。

7 、db/db 小鼠

db/db 小鼠糖尿病发病系瘦素受体突变所致,呈常染色体隐性遗传。 该鼠在10~14 日龄时就出现多食、高胰岛素血症,但4周龄时血糖仍维持正常,随后该鼠体重逐渐增加,出现高血糖。2~3 月龄时尽管胰岛素水平为正常时的 6~10 倍,但血糖水平可达 22~33mmol/L。

约 3~6 月龄时胰岛素水平逐渐下降至低于正常水平,该期小鼠体重明显下降,并出现酮症,组织学显示显著的β细胞坏死,如缺乏胰岛素治疗,该小鼠存活不超过 10 月。db/db 小鼠另一个特点为:其血清胰高糖素的水平较正常对照升高 2 倍以上。db/db 小鼠是适用于研究2型糖尿病发病机制的动物模型。

8、 ob/ob 小鼠

ob/ob 小鼠为 2 型糖尿病模型动物,属常染色体隐性遗传。ob/ob 小鼠糖尿病发病是由于 ob 基因突变,造成其编码的蛋白 leptin 缺乏,引起肝脂肪生成和肝糖原异生显著增加,高血糖又刺激胰岛素分泌,引起胰岛素抵抗,刺激脂肪的形成。ob/ob 小鼠体重可达 90 克之多。ob/ob 小鼠症状的轻重取决于遗传背景。纯合体动物表现为肥胖,明显的高血糖及高胰岛素血症。ob/ob/6J 小鼠胰岛素水平可达正常小鼠的 10~50 倍,但其血糖常只有轻度的升高。组织学显示 ob/ob 小鼠胰岛β细胞显著增生、肥大,而胰岛 A 细 胞、D 细胞及 PP 细胞数量明显减少。

9 、KK 鼠

KK 小鼠是一种轻度肥胖型 2 型糖尿病动物,它与 C57BL/6J 小鼠杂交,并进行近亲繁殖,得到 Toronto-KK(T-KK)小鼠。

将黄色肥胖基因(即 Ay)转至 KK 小鼠,KKAy 鼠,与 KK 小鼠相比,KKAy 鼠有明显的肥胖和糖尿病症状。KK 小鼠有明显的多食,从 5 周龄起血糖、血胰岛素水平逐步升高,至 5 月龄时体重可达 50 克,非空腹血糖常低于 17mmol/L,非空腹血胰岛素可达 1200ug/mL;1 岁龄时多食、高血糖、高胰岛素血症、肥胖及肝脏对胰岛素的敏感性可自发恢复正常,但糖尿病 KK小鼠生命常明显缩短。此外,KK 小鼠空腹胰高糖素水平升高,且不受葡萄糖抑制。组织学显示 β 细胞有脱颗粒和糖原浸润,随后出现胰岛肥大和肝脂肪化和脂肪组织增多。

四、其他 DM 动物模型

(一)激素性 DM 动物模型:注射垂体前叶提取物、生长素、肾上腺皮质激素、甲状腺素或胰高血糖素均可直接或间接产生 DM。

(二)病毒性 DM 动物模型:利用脑-心肌炎病毒(EMC-M病毒)和柯萨基病毒等使某些种属的小鼠胰岛β细胞脱颗粒、坏死,导致胰岛 β 细胞破坏,产生类似的 1 型 DM。

(三)免疫性 DM 动物模型:静脉注射抗胰岛素抗体或用同种或异种胰岛素的弗氏佐剂复合物及抗血清免疫;或用同种或异种胰腺+弗氏佐剂免疫动物均可在数小时后产生一过性高血糖。其机制是内源性胰岛素与输入的抗体结合导致内源性胰岛素降低而致 DM。

(四)下丘脑性 DM 动物模型:用电凝法或注射硫代葡萄糖金损伤丘脑下部腹内侧核(VMH)饱中枢,可使成熟动物产生过度摄食、肥胖,直至产生DM。

五、转基因糖尿病动物模型

转基因动物技术是通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造,并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现。

利用这一技术,人们可以在动物基因组的特定位点引入所设计的基因突变,模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常。可以通过对基因结构进行修饰,在动物发生、发育的全过程中研究体内基因的功能及其结构功能的关系。有关 1 型、2 型 DM 和青少年发病的成人型糖尿病(maturity-onset diabetes of youth,MODY)的转基因 DM 动物均有报道。

(一)MKR 小鼠动物模型

MKR 小鼠是由 Fernández 等培育出的 2 型 DM 转基因动物模型。该小鼠骨骼肌过度表达失活的 IGF-1 受体,失活的 IGF-1 受体与内源性 IGF-1 受体及胰岛素受体形成杂合受体,干扰这些受体的正常功能,导致明显胰岛素抵抗。该小鼠 2 周龄即有明显的的高胰岛素血症,5 周龄后空腹及进食后血糖逐渐升高,7~12 周龄即有明显糖耐量异常。PPAR- 激动剂 WY14、643治疗可纠正 MKR 小鼠糖代谢异常。

(二)MODY2 动物模型

zhang 等利用基因敲除技术制得肝脏葡萄糖激酶(GCK) -小鼠,发现随着时间延长,该鼠血糖逐渐升高,糖耐量减退,6 周龄小鼠空腹血糖显著高于对照组小鼠,这种肝细胞GCK活性减退所引起的疾病与人 MODY 相似,可作为 MODY 的动物模型。

(三)线粒体糖尿病

Silva 等发现 β 细胞Tfam(mitochondrial transcriptionfactor A)突变的小鼠,大约 5 周龄时发生糖尿病,表现为严重 mtDNA 耗竭,氧化磷酸化不足和7~9 周时胰岛内可观察到异常的线粒体,呈现线粒体糖尿病的改变。

(四)GDM(妊娠糖尿病)模型

妊娠期胰岛素抵抗可引起妊娠糖尿病,患者胎儿典型特征是巨大儿,成年后患肥胖和 2 型糖尿的概率上升。Yamundefined*a等发现杂合体 C57BL/PKsJ-db/+ 小鼠发生 GDM。妊娠引起 PI3K 与 IRS-1 解离,与IR结合活性增加,胰岛素介导的精氨酸磷酸化增多而 IRS-1 表达及其酪氨酸磷酸化减少从而使 IRS-1 结合及激活 PI3K 能力下降,胰岛素功能不能发挥,出现胰岛素抵抗。

(五)为了研究 B 淋巴细胞在 1 型 DM 发病中的作用,Wong 等利用转基因技术制得了 NOD-RIP-B7-1(Nonobese Diabetic-Rat Insulin Promoter-B7-1)转基因小鼠,该小鼠由于过度表达辅助刺激因子 B7.1 而致 DM 发病时间较正常 NOD 小鼠明显提前,在 12 周龄即发生 DM。

随着对 DM 研究的逐步深入,相应的 DM 动物模型发展势在必然,转基因动物的建立将为 DM 研究提供更科学有效的工具。

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