基因工程的操作步骤和几个重要概念

基因工程的诞生

基因工程是分子水平对生物遗传作人为干预，要认识它，我们先从生物工程谈起：生物工程又称生物技术，是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术，利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工，提供大量有用产品的综合性工程技术。

生物工程的基础是现代生命科学、技术科学和信息科学。生物工程的主要产品是为社会提供大量优质发酵产品，例如生化药物、化工原料、能源、生物防治剂以及食品和饮料，还可以为人类提供治理环境、提取金属、临床诊断、基因治疗和改良农作物品种等社会服务。

生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程等 5 个部分。其中基因工程就是人们对生物基因进行改造，利用生物生产人们想要的特殊产品。随着 DNA 的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由信使 RNA 转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。如果将一种生物的 DNA 中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的 DNA 链上去，将 DNA 重新组织一下，不就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型吗？这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同，它很像技术科学的工程设计，即按照人类的需要把这种生物的这个「基因」与那种生物的那个「基因」重新「施工」，「组装」成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就被称为「基因工程」，或者称之为「遗传工程」。

基因工程的几个重要概念

目的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体内能表达产生所要蛋白产物。生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于细胞质中。取得目的基因的办法是用「分子剪刀」剪切供体 DNA 分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所需目的基因的 DNA 片段。到目前为止，人们这种方法已分离出 40 种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。

另一种获得目的基因的方法是人工合成。随着技术的进步，已有用于自动测定 DNA 顺序的专门仪器和自动合成 DNA 仪器。还有一种基因合成方法是模板合成。随着技术的进步，已有用于自动测定 DNA 顺序的专门仪器和自动测定 DNA 顺序的专门仪器和自动合成 DNA 的仪器。

还有一种基因合成方法是模板合成法。基因工作指令的传递是按照「DNA-RNA-蛋白质」这一方向进行的，相反的信息传递即由 RNA-DNA 也存在。基因模板合成法就是先以信使 RNA 为模板，反向转录出一条 DNA 单链，再以互补的方式加倍成 DNA 双链。用这种方法人们已先后合成了家兔、鸭和人的珠蛋白基因、羽毛角蛋白基因等。

载体：目的基因片段很难直接转入生物体细胞，而且由于它自身常无 DNA 复制所需信息，在细胞分裂时不能复制给子细胞，就会丢失，所以人们要把它连在一些能独立于细胞染色体之外复制的 DNA 片段上，这些 DNA 片段就叫载体。常用的载体有质粒和病毒。当然载体还有其它作用，如促进目的基因转化、表达等。人们对天然质粒及病毒进行了一系列改造，如加上耐药性基因片段等，提高基因的转化、筛选、表达效率。

限制性内切酶： 在细菌内存在的一类能识别并水解外源 DNA 限制性内切酶，它具有极好的专一性，能识别 DNA 上的特定位点，将 DNA 的两条链都切断，形成粘性末端或平末端。DNA 经限制性内切酶切割后产生的具有碱基互补单链的末端称为粘性末端。限制性内切酶的生物学功能在于降解外面侵入的 DNA 而不降解自身细胞的中的 DNA，因自身 DNA 的酶切位点经修饰酶的甲基化修饰而受到保护。限制性内切酶较为稳定，常用的约 100 多种，并已大多转化为商品。限制性内切酶在分析染色体结构、制作 DNA 的限制酶图谱、测定较长 DNA 序列以及基因的分离、基因的体外重组等研究中是不可缺少的重要工具酶。

转化：重组 DNA 进入受体的过程叫「转化」，得到重组 DNA 的细胞叫「转化细胞」。目的基因难以直接送进受体细胞。因为地球上的生物都是长期历史进化的产物，都有保卫自身不受异种生物侵害和稳定地延续自己种族的功能。如果外来的 DNA 闯进受体细胞，受体细胞就会把它「消灭」。当外来的 DNA 进入大肠杆菌时，大肠杆菌内部的内切酶就会使其「粉身碎骨」。

因此，目的基因的直接导入往往不通。在这种情况下，生物工程师们就要采用 DNA 重组技术。首先将目的基因与质粒经过内切酶的「裁剪」，然后靠连接酶的作用，将目的基因和质粒（或病毒 DNA）重新组合起来形成重组 DNA。 重组 DNA 就能在质粒（或病毒 DNA）的「带领」下进入受体细胞。

基因工程的操作步骤

包括 4 步：获取目的基因、重组 DNA、将拼好的 DNA 送入受体细胞并使之表达基因工程一般包括四个方面的基本内容：一是取得符合人们的要求的 DNA 片段，这种 DNA 片段被为「目的基因」；二是将目的基因与质粒或病毒 DNA 连接成重组 DNA（质粒和病毒 DNA 称作载体）；三是把重组 DNA 引入某种细胞（称为受体细胞）；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。DNA 分子很小，其直径只有 20 埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行「手术」是非常困难的，因此基因工程实际上是一种「超级显微工程」，对 DNA 的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。

首先，要把所需基因——目的基因从供体 DNA 长链中准确地剪切下来。1968 年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶能够在 DNA 上寻找特定的「切点」，认准后将 DNA 分子的双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为「分子剪刀」。这种「分子剪刀」可以完整地切下个别基因。自 70 年代以来，人们已经分离提取了 400 多种「分子剪刀」，其中许多「分子剪刀」的特定识别切点已被弄清。有了形形色色的「分子剪刀」，人们就可以随心所欲地进行 DNA 分子长链的切割了。

由于限制性内切酶的发现，阿尔伯、史密斯和内森斯共享 1978 年诺贝尔生理和医学奖。 DNA 的分子链切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976 年，科学们在 5 个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个 DNA 片段连接起来，修复好 DNA 链的断裂口。1974 年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作 DNA 连接酶。从此，DNA 连接酶就成了名符其实的「缝合」基因的「分子针线」。只要在用同一种「分子剪刀」剪切的两种 DNA 碎片中加上「分子针线」，就会把两种 DNA 片段重新连接起来。 把「拼接」好的 DNA 分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的 DNA 片段后仍能照样复制的运载体。 基因的理想运载工具是病毒和噬菌体，病毒不仅在同种生物之间，甚至可以在人和兔培养细菌细胞转移。还有一种理想的载体是质粒。质粒能自由进出细菌细胞，当用「分子剪刀」把它切开，再给它安装上一段外来的 DNA 片段后，它依然如故地能自我复制。

因此，它是一种理想的运载体。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就如可以愿以偿了。 把目的基因装在运载体上，运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步。一般情况下，转化成功率为百万分之一。为此，遗传工程师们创造了低温条件下用氯化钙处理受体细胞和增加重组 DNA 浓度的办法来提高转化率。采用氯化钙处理后，能增大体细胞的细胞壁透性，从而使杂种 DNA 分子更容易进入。目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒 PSC100 作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。