PCR 技术在基因研究上的应用

尤其是 PCR 技术问世以后，各种与 PCR 相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。如不对称 PCR 产物的直接测序 、核糖核酸酶酶切法 (Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 等等已成为基因分析的有力工具。

但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用。1989 年问世的 PCR-SSCP(下文称 SSCP) 作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于 DNA 定量分析，监测 PCR 诊断实验中的交叉污染情况，以及传染源的调查等。

由于 SSCP 的突出的优点，近几年被大量地应用。

日本 Orita 等研究发现，单链 DNA 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链 DNA 分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同。

因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开。作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP) 分析。

在随后的研究中，作者又将 SSCP 用于检查 PCR 扩增产物的基因突变，从而建立了 PCR-SSCP 技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。其基本过程是：

①PCR 扩增靶 DNA;

②将特异的 PCR 扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链 DNA 分子;

③将适量的单 链 DNA 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;

④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链 DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该 DNA 片段中有碱基突变。

该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要. 但它也有不足之处. 例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序，电泳条件要求较严格。

另外，由 于 SSCP 是依据点突变引起单链 DNA 分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链 DNA 分子立体构象的改变不起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。

尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率. 首先，它可以发现靶 DNA 片段中未知位置的碱基突变.Takao，经实验证明小于 300 bp 的 DNA 片段中的单碱基突变，90% 可被 SSCP 发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。

另外，SSCP 方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链 DNA 分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从 DNA 序列水平上鉴别突变 DNA 片段。

SSCP 技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入 PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果. 这给该技术的推广造成一定的困难。

随着 DNA 银染方法与 PCR-SSCP 结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP 值得注意的改进是将 DNA-SSCP 分析，改为 RNA-SSCP 分析，其基本原理是：RNA 有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达 90% 以上。

另外，RNA 不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色. 但该方法增加了一个反转录过程; 还需要一个较 长的引物，内含有启动 RNA 聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度。

为了进一步提高 SSCP 的检出率，可将 SSCP 分析与其它突变 检测方法相结合. 其中与杂 交双链分析 (Heterocluplex analysis，Het) 法结合可以大大提高检出率。

Het 法是用 探针与要检测的单链 DNA 或 RNA 进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 补的杂交链在非变性 PAG 凝胶上通过电泳被分离开. 对同一靶序列分别进行 SSCP 和 Het 分析可以使点突变的检出率接近 100%，而且实验简便.