1 个关键药物，实现小鼠全能干细胞体外捕获和长期维持，北大杜鹏 Cell 报道新技术
丁香学术
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背景介绍
干细胞研究与再生医学、辅助生殖、癌症、代谢紊乱和衰老有着广泛的联系，其中，在体外捕获和维持具有高分化潜能的胚胎干细胞 (ESCs) 是进行干细胞相关研究的基础。目前，体外培养的 ESCs 通常来自于内细胞团，能够分化为成年生物体的任何细胞类型，具有最高的发育潜能。但是到目前为止，在体外捕获和维持与体内全能卵裂球分子和功能相似的全能干细胞仍然是领域内的难题。
剪接体是由 5 个核心亚基和若干辅助因子组成的大分子核糖核蛋白复合体，是信使 RNA (mRNA) 剪接和成熟的动态分子机器。最近的研究表明，剪接体也可以直接调控转录的起始、延伸和终止；除此之外，在许多不同的癌症中，几个关键剪接因子的突变在肿瘤发生中起着重要的作用。然而，剪接体在干细胞命运转变和早期胚胎发育中的可生理相关性尚不清楚。
2021 年 5 月 14 日，北京大学杜鹏等团队在国际顶级期刊 Cell 在线发表了题为 Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression 的研究性文章， 报道了小鼠 ESCs 中的剪接体抑制能够驱动多能到全能状态的转变，为捕获和维持干细胞的全能性提供了一种可行的方法。
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主要研究内容
剪接体抑制可激活小鼠 ESCs 的全能性
首先，研究人员对先前发表的小鼠和人类胚胎的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 数据进行挖掘，结果发现，8 细胞胚胎期后，85 个剪接因子和 117 个剪接因子在小鼠和人体内均有明显的表达上调，其中 60 个剪接因子具有保守性，这一结果反映了动态剪接体表达与体内早期胚胎发育可能存在密切联系。
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接下来，为了验证动态剪接体变化是否控制着体外全能 / 多能干细胞的转化。他们在小鼠多能 ESCs 中使用合成 siRNA 敲降了属于不同剪接体亚基的 14 个剪接因子，后续的检测结果显示，剪接体的抑制可普遍激活小鼠 ESCs 中的全能基因。
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为了进一步验证上述发现，他们对这些细胞进行了全转录组测序分析。正如预期的那样，剪接体抑制通常激活全能性标记，如 ZSCAN4s 和 ZFP365；然而，核心多能性因子的表达，包括 POU5F1, NANOG，SOX2 和 ZFP42 却出现表达降低。那些具有显著差异的因为大多与胚胎发育相关的生物学过程相关。因此，这些结果表明，剪接体是 ESC 命运决定的关键调控因子，而剪接体的抑制可通过广泛激活全能基因和沉默多能基因，将多能干细胞转变为全能状态。
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Pladienolide B (PlaB) 是一种天然的抗肿瘤大环内酯的类似物，它能与 SF3B 复合物结合以抑制剪接体和剪接功能。根据上面的结果，SF3B 亚基的敲除激活了全能性标记基因，因此他们推测 PlaB 亦可以驱动多能细胞向全能细胞的转变。随后，他们向培养体系中添加了 PlaB，结果发现，在实验组，ESCs 的典型球形形态和全能性基因的激活在 16 代后仍然保留。
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为了详细描述 PlaB 的添加对细胞的影响，他们对不同传代的细胞进行了全转录组测序分析。转录组学分析表明，与 PSCs (P0) 相比，许多全能性基因在受精卵和 2 细胞和 4 细胞胚胎中特异表达，包括 ZSCAN4s、DDIT4L、PLK2、BTG1/2、ZFP352 以及 MERVL、MT2 均明显上调，而 SOX2、DPPA5A、ZFP42 等典型多能基因在 P5-P10 细胞中却明显下调。
综上所述，使用剪接体抑制剂 PlaB，他们成功地开发了新的培养基，它不仅可以使小鼠 PSCs 重编程到全能状态，而且可以在体外多代维持具有高染色体稳定性和细胞活力的全能细胞。由于这些全能细胞具有接近 2 细胞和 4 细胞囊胚的独特转录特征，因此他们将这些细胞命名为全能囊胚样细胞 (Totipotent Blastomere-Like Cells, TBLCs)。
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多组学解析 TBLCs 的分子特征
为了在多分子水平上表征 TBLCs，他们对 TBLCs 进行了多组学分析。核糖体谱测序分析 (Ribo-seq) 显示，TBLCs 与 PSCs 进行比较时，有 2581 个和 837 个基因表现出上调和下调，上调的基因包含了全能性基因 ZSCAN4s、DDIT4L、SP110 等，下调的基因包含了多能基因 POU5F1、ZFP42、SOX2 等。
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采用全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS)，他们分析了 TBLCs 和 PSCs 的 DNA 甲基化特征，总的来说，他们发现 PSCs 中 CpG 甲基化水平为 71%，接近胚胎第 6.5 天前后；而在 TBLCs 中，整体甲基化降低到 35%，这与 2 细胞和 4 细胞的全能卵裂球相当。
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研究者还对 TBLCs 和 PSCs 进行染色质可及性的检测 (ATAC-seq)。结果发现，与 PSCs 相比， TBLCs 在基因组上有 30,602 个开放峰和 24,519 个封闭峰。在这些位点中，有 1935 个是开放峰、2322 个闭合峰在转录起始位点 (TSSs) 附近，这与 2 细胞和 4 细胞胚胎相似。
因此，使用多组学分析，他们在不同水平描述了 TBLCs 的分子特征，并得出其与 2 细胞和 4 细胞囊胚相似的结论。
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TBLCs 的多潜能分化能力
与只产生胚胎组织三个胚层的 PSCs 不同，全能细胞具有胚胎发育和胚胎外发育的潜能。接下来，他们用嵌合体形成实验检测了 TBLCs 的分化能力。通过监测嵌合囊胚中注射的供体细胞的分布，发现在内细胞团和滋养外胚层均检测到了 TBLCs 来源的细胞。作为对照， PSCs 只能在内细胞团检测到。因此，这表明 TBLCs 有能力参与嵌合囊胚的内细胞团和滋养外胚层。
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为了证明 TBLCs 可以在细胞水平分化为胚胎外细胞，他们对包含三层的胎盘切片进行了免疫组化分析。结果表明，在未注射供体细胞的对照胎盘中，未检测到 EGFP + 细胞；TBLCs 分化的 EGFP + 细胞则广泛分布在 Junctional zone 和 labyrinth 区域，这表明 TBLCs 能够产生滋养细胞。
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最后，为了在单细胞分辨率下解读胚胎外组织中 TBLCs 的不同分化命运，他们使用流式分选术对从胎盘和卵黄囊中分离的 TBLCs 衍生的 EGFP + 细胞进行了单细胞转录组测序分析。通过生物信息学分析，他们共鉴定了 6 胚胎外细胞谱系，15 个胚胎细胞系。这表明 TBLCs 具有强大的双向发育潜力，可与体内的全能卵裂球相媲美。
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研究总结
综上所述，在本研究中，该研究团队通过剪接体抑制实现了小鼠全能干细胞的体外建立和培养，并生成了被命名为 TBLCs 的细胞，其分子和功能接近体内的 2 细胞和 4 细胞囊胚。这项研究不仅提供了一种体外捕获和培养全能干细胞的方法，而且强调了剪接体在干细胞命运转变中的关键作用。
参考资料：
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