细胞如何计数？

1.原理

计算细胞数目可用血球计数盘或是 Coultercounter 粒子计数器自动计数。

血球计数盘一般有二个 chambers，每个 chamber 中细刻 9 个 1 mm² 大正方形，其中 4 个角落之正方形再细刻 16 个小格，深度均为 0.1 mm。当 chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为 1 mm²×0.1 mm=0.0001 mL。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以 10000，即为每 mL 中之细胞数目。

存活测试之步骤为 dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之 trypan blue 染料，如果细胞不易吸收 trypan blue，则用红色之 Erythrosin bluish。

计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

2.材料

0.4% w/v trypan blue

Erythosin bluish stain

取 0.1 gram Erythrosin bluish 及 0.05 gram preservative methyl paraben 溶于 100 mL Ca++/Mg++ freesaline

血球计数盘及盖玻片

计数器

低倍倒立显微镜

粒子计数器

白细胞稀释液（4% 乙酸溶液）。

3.步骤

（1）取 50 μL 细胞悬浮液与 50 μL trypan blue（or Erythrosinbluish）等体积混合均匀于 1.5 mL 小离心管中。

（2）取少许混合液（约 15 μL）自血球计数盘 chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 (或红色 Erythrosin bluish)。

（3）计数四个大方格之细胞总数，再除 4，乘以稀释倍数 (至少乘以 2，因与 trypanblue 等体积混合)，最后乘以 10000，即为每 mL 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞 (或计下线与左线之细胞)。

注：4 大格细胞总数×稀释倍数×10000/4=细胞数/mL；每一大格的体积=0.1 cm×0.1 cm×0.01 cm=0.0001 mL 。

计数板计数时，最适浓度为 5～100000 细胞/mL，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

4.范例

T75 monolayer culture 制成 10 mL 细胞悬浮液，取 0.1 mL 溶液与 0.1 mL trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243 。

平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2

细胞数/mL：60.75×10000×2（稀释倍数）=1.22×10000000

细胞数/flask（10 ml）：1.22×1000000×10 ml=12.2×10000000

存活率：225/243﹦92.6%

5.要点

（1）计数板和盖玻片擦拭好，绸布拭干。

（2）充分混匀细胞悬液（细胞活力高时，不必用胎盘兰染）。

（3）吸管取 1 滴至计数板：

吸管吸取细胞，让吸管在计数板一侧的凹槽处流出液体，至盖玻片被液体充满为止，不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡；（有人认为，10 uL 就可以被虹吸作用吸入且铺满计数板）。

移液器（20 μL 的微量加样器）吸取 20 μL 细胞悬液至计数板边缘，液体经虹吸作用进入凹槽。

（4）静置半分钟。

（5）在显微镜下观察（10 × 物镜），2 个以上细胞组成的细胞团按一个细胞计算，压线的细胞只计上线和左线者（防止细胞被重复计数）。

4 大格 _细胞总数 _2_*_10000~H4_~L_细胞数/mL * 每一大格的体积 = 0.1 cm x 0.1 cm x 0.01 cm = 0.0001 mL

作者：zjlijing