一款超好用的在线引物设计软件

看到有很多战友为引物的设计感到头疼。不过这也难怪，虽然原理我们都知道，但是设计的时候却未必能都考虑的很完全。

在这里我向大家隆重推荐一个在线的引物设计软件，是斯坦福大学的，我认为是最好的在线引物设计软件，我用它设计接近 100 多对引物。它用起来也很简单，最重要的是效果非常好，考虑的因素也非常的多。

具体操作如下：

首先输入你想要 p 的片断，含有数字也无所谓，选择 pcr 选项。

点击「submit」进入下面的页面。其中在 Select YES to Amplify a region with EXACT endpoints of the DNA sequence entered NO YES 这一项中，一定要选择 YES，其他的各项目，大家可以点击查看说明，也都是非常的好理解。暂时，我们先不要改软件自设的默认值，直接 submit 。

然后我们就得到了结果，它会把所有可能的引物都会列出来，而且会把最好的一对帮你挑选出来，of course，我们要选择最好的。

然后点击「This is the BEST pair of primers」就得到了设计好的引物。而且也会显示出「The sequence of DNA that will be amplified by these primers is」如果你不放心，你可以将该序列和你的原始序列比较一下，不会有问题的了。

当然这是最顺利的情况，但是有时并不是这么简单，例如我前两天帮一个战友设计引物，他想要的序列：

atcgat cagattatca aataatatac caaaattgat acatatgata catatgaatg

721 atatatgttt tggatatatt atttgttaaa attaattcat caggtgatga tgtgatgata

781 atcattgaaa aatgacaaaa atcccctgat taagtataat aaaaatagta agtaaaaaag

841 gcaaattttt acttacaaaa tattacatat tggaataaat aatttaatct ttcatatata

901 taactgtgat acatcataaa tatatatata gcaaaagaaa gatataaatt attatcattt

961 tttttgatca ttattgctat aattattatc ctgcttgttt aactataata atagcaatga

1021 atgaatcaaa atttaaatga tacgttaaaa tccaaccaat atgttataaa ttttctttca

1081 ttt

我们直接提交得出的结果：

这样的话，按照默认的设的值并不能得到合适的引物，很明显如果让我们自己人工设，可能就不会考虑这么的详细：首先第一个问题，GC 含量太低。

为了重新设计，我们点击浏览器上的后退，回到前一页，也就是默认值的设定这一页。

我们可以改两个地方，第一，Optimum primer length： Minimum length: Maximum length：中，我们可以将 Maximum length 改成一个更大的值，例如 35；Minimum GC 改成 20，然后 submit，可是我们发现还是有问题。

这一次的原因是引物自己配对的问题，同样我们回到前一页，这次我们把 Self End Anneal 由原来的 12 改成 16，submit 。这样我们就得到了新的引物。

就这样，有时默认值不行的，可以微调一样，便很容易得到比较理想的引物。我用了那么久，几乎从来没有问题。大家可以随时点击「info」选项，进一步深入了解每个选项的意思。