写给细胞小白的实用手册

转眼间这学期已经快过去一半了，该是时候进入实验室学习实验技能，初来乍到的你会不会因为「笨手笨脚」被师兄师姐嫌弃呢。不要担心，本文为各位细胞小白带来细胞实验步骤和细节讲解，希望你看过之后能对细胞实验有个清晰的了解，只要你足够的细心，看完之后完全有能力自己独立操作哦……

基本准备工作

灭菌、消毒

1. 无菌室和操作区消毒

实验前用 70% 乙醇擦净洁净台，再将实验器材放入超净工作台，打开紫外线灭菌灯，40 分钟后消毒完毕，关闭紫外线灯，打开吹风，注意两扇门不要同时打开。细胞房每周都要打开房间的紫外线灭菌灯进行整体消毒。长期未使用的细胞房在实验前需要用 20% 乙酸蒸 24 h。

2. 二氧化碳培养箱消毒

二氧化碳培养箱定期需要用 70% 乙醇擦拭托盘和内壁，同时使用手提紫外灯进行消毒。培养箱低端托盘的水也要为无菌水，并两周更换一次。

3. 器皿灭菌、消毒

玻璃器皿和螺口盖采用高压灭菌（121 ℃，100 kPa，20 min），玻璃器皿包括移液管、冻存瓶、盖玻片、载玻片、玻璃注射器、玻璃试管、吸管等。 螺口盖的盖子分为有內垫的金属或酚醛树脂盖、聚丙烯盖子、硅树脂盖子、白橡胶盖子。塑料器皿的消毒通常采用紫外照射 4～6 h 的方法。PBS、hanks 等平衡盐溶液中的葡萄糖、高压灭菌时会融化变焦，所以要等高压灭菌之后再加。

4. 试剂和培养基

这类物质一般采用 0.22 μm 滤膜除菌。

基本手法

1. 用微量移液器在吸取和加入液体时，枪头须伸入瓶口以降低在空气中污染的几率；

2. 像试剂瓶、培养瓶中加入试剂时，一般为右手持微量移液器，左手食指和拇指握住瓶身，食指和中指夹住瓶盖，并使瓶身适当的倾斜，尽量不要让瓶身竖直，更不能用手触摸瓶口。手小者可以将瓶盖扣在超净工作台的台面上。

3. 试剂瓶、培养瓶等盖上盖子前需要将盖子在酒精灯上晃一秒钟。

超净工作台物品摆放

复苏

1. 准备工作：提前开启恒温水浴锅，将温度调节在 37℃～41℃ 之间；取一细胞培养瓶，加入预热的完全培养基。提前加入培养基有助于接种时细胞能够均匀分散。

2. 取细胞：从液氮罐中取出细胞。从液氮罐中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

3. 融化：从液氮中取出冷冻管，立即放入水浴锅中快速解冻，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段 （-5～0 ℃），并在 1 分钟内完成融化，以 70% 酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

4. 接种：打开冻存管，室温下 5 min 内将冻存液小心转移到预先加入有培养基的培养瓶中，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。

5. 换液：十二小时内进行换液，除去上清液中的冻存液。或者在融化之后将细胞加入到含有培养基的离心管中，800 rpm 离心 5 分钟，去上清，加入新鲜培养基，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。

传代

1. 弃旧：将原有的培养液吸净。

2. 漂洗：加入适量的 PBS 缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将 PBS 缓冲液弃掉。（原因：血清会抑制胰蛋白酶的消化作用）。

3. 消化：每瓶加入 1 mL 消化液，在 37 ℃ 环境中进行消化，轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面。

4. 观察：在倒置显微镜下待 1/2 细胞变圆后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到「薄膜」现象时，倒掉消化液，再继续作用 2～3 分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。

5. 终止：加入完全培养基 5 ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。

6. 离心去上清液： 1 100 rpm，5～10 分钟，去除培养基（含胰酶及 EDTA），沉淀物为细胞。

7. 计数：在显微镜下进行细胞计数。按 5×106 细胞密度接种细胞，即吸出 1 ml 细胞母液加入新的培养基。

8. 传代：用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可 1:3 至 1:5 传代，在 25 cm2 的培养瓶中长满细胞可达 undefined106/ml，经 10 倍稀释每瓶达 105/ml 即可，25 cm2的培养瓶每瓶 5 ml 培养液）。再将培养物重新放回 5% CO2、37 度培养箱中。

或者在消化时看到细胞有脱落的迹象即可去除消化液，加入适量的培养基轻轻吹打瓶壁，根据细胞密度按照比例接种到细胞培养瓶。经长期对比发现，此方法比离心传代对细胞的损害较小。

冻存

1. 选择处于对数生长期的细胞。在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用 0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液，然后将细胞收集于离心管中离心 （800 r/min，20 S）。

2. 配制冷冻保存溶液 （使用前配制）：另取一离心管，加入基础培养基，逐滴加入二甲基亚砜 （DMSO），即制冻存 B 液，置于室温下待用，胎牛血清作为冻存 A 液，基础培养基：DMSO：胎牛血清 = 5:4:1。

3. 细胞悬液和冻存液混匀：细胞离心毕弃去上清液。用血清重悬起细胞，缓慢加入冻存 B 液，轻轻吹打使细胞均匀。

4. 分装：分装在 1 ml 冷冻管中，严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。

5. 梯度降温冻存： 4 ℃，30 min → -20 ℃，10 min → -30 ℃，30 min→ -70 度冰箱过夜 → 置于液氮灌中保存。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。

总之，细胞实验前一定要检查实验用品和试剂等是否准备齐全，如果实验过程中发现物品准备不齐全，建议暂停实验，将物品放入超净工作台中重新消毒。为了保证细胞实验的顺利进行一定要保证全过程无菌，即试剂无菌、器皿无菌、操作无菌！