双酶切连接反应之全攻略

生物学霸2016-07-08

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前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用两周重组了 14 个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。

一、回收 PCR 产物

在进行 PCR 扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如 BamHI、HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的 BUFFER，以及各酶在公用 BUFFER 里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切三个小时，其实一个小时已经足够。应用大体系，如 100 μL。

纯化问题：纯化 PCR 产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR 产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是 TAKARA 的纯化柱试剂盒。

酶量的问题：以 TAKARA 的为例，其对一单位酶的定义如下：在 50 μL 反应液中，30℃ 温度下反应一小时，将 1 μg 的 λDNA 完全分解的酶量定义为一个活性单位 (U)。而该酶浓度约为 15 单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解 15 μg 的 DNA，而一般从 1-4 mL 菌液提出的 DNA 约为 3 μg，而 PCR 纯化后的产物（50 体系）约为 3 μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

二、酶切回收后的 PCR 产物与载体的连接

摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段 =1：10　，一般取前者 0.03 pmoL，后者取 0.3 pmol。

pmoL 为单位的 DNA 转换为为 µg 单位的 DNA：（X pmoles × 长度 bp × 650）/ 1 000 000（注：长度 bp × 650 是该双链 DNA 的分子量）所得数值即为 µg，也可以直接用这个公式套 1 pmoL 1000 bp DNA = 0.66 μg，如载体是 5380 bp，则 0.03 pmolL 为 0.03 × 5.38 × 0.66=0.106524 µg。

测 DNA 浓度可以在专用机子上测，注意 OD 值，一般约 1.8-2.0 。另外，如果嫌麻烦，也可用 MARKER 进行估测，如 MARKER2000，5 μL 的 MARKER 每个条带约 50 ng。

连接反应：TAKARA 的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在 20 μL 的连接反应体系中，6 μg 的 λDNA-Hind III 的分解物在 16℃ 下反应 30 分钟时，有 90% 以上的 DNA 片段被连接所需要的酶量定义为一个活性单位（U）。而它的浓度为 350 U/μL ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间三个小时足已。

三、转化

1. 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为 Ligase 酶很容易降解。为保险起见，一般连接三小时，16 度。

2. 对含有 AMP-RESISTENCE 的质粒铺板时，注意加 AMP 时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来. 我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60 度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。

3. 对照的设立

为验证双酶切是否成功，可做如下对照：A 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种 BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性。如两管均成线性可初步判断双酶切成功。

做转化时，也要进行对照。设四个：

（1）即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功, 如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆, 则证明双酶切成功，当然要保证感受态、培基、连接酶都「正常」的情况下。

（2）酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。

（3）设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。

（4）AMP 阴性板上用同一批感受态细胞铺板 20 微升足够，检测感受态状况。

4. 所有的试剂切记低温保存，一步一个脚印，不要偷懒，图省事最后却更费事，注意设立对照。

经 PCR 鉴定，克隆 90%~100% 的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选四个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。

文章作者：丁香园版主@ springwel

图片来源：互联网