美国留学博士后谈载体构建心得

这两年在美帝净做克隆实验了，专家不敢说，但是熟能生巧，确实积累了不少经验。我把经验写下来，希望大家少绕点弯路。

1. 载体构建

俗话说用欲善其事，必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。

这里说个笑话，我们系有个新 PHD 学生，是个印度女孩，很聪明很刻苦，她所在的实验室也很好，不过除了她之外包括老板在内都是生物物理背景的，以前一个生物 POSTDOC 在的时候还好，这个 POSTDOC 一走，整个实验室对分生就只有一个粗浅的概念，这个女孩就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这女孩她不懂啊（要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂），自己辛辛苦苦设计了 PCR 引物去做 PCR，P 了将近 5 K 的产物去测序，结果测的结果中间有个 MUTATION，要懂行的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测这下这段就行。她呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，一个测序反应这边是 八美元，一个质粒测下来就是 40 美元，她光测序就要花好几百美元。

这件事教育我们准备工作是多么重要。

这里推荐大家两个工具，一个都知道的 PRIMER 5.0 。另一个工具极强大，也不知道国内流行不，叫 lasergene，包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等超牛。

2. PCR

如果没有现成的质粒可供酶切，PCR 是最理想也是最方便的策略。

如何设计引物？

首先，看懂质粒图谱。

拿大家比较熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。想用 N1 质粒，设计引物就得把下游引物上的终止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了。C1 质粒，注意 frame，要是移码了，你也死了。而且 PEGFP 系列有 1、2、3，要弄清楚别弄窜了。

一句话，要看懂你的图谱！再多一句，PEGFP 的 Xba 1 和 Bcl 1 位点不能用。

注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基（如果用 T 载体可以不用在意）。酶切位点设计也有一定的讲究，我的原则是，能用粘端就用粘端，实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如 EcoRV 和 SNAB 1 之类，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算 TM 的时候要减去这些不 match 的序列，或者选用 touch-up 策略。

除了酶切位点，还要注意 KOZAK 序列的问题，很多质粒没有提供 KOZAK 序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。

GENE OVERLAP 也比较有用，比方说加个 FLAG 片段，HIS 片段，2 A 序列之类的，直接设计三引物 OVERLAP 一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。

引物长一点不要紧（我最喜欢两步法了），尤其是对 GC 高的序列。有时候引物不长 PCR 根本不出结果，注意如果 GC 比较高，这个时候 GENE OVERLAP 就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。

没有合适的酶切位点？

很简单，用同尾酶策略，比方说 Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧，只要不超过 4 KB，平端酶连接也不那么难。

如何选择 Taq 酶？

选择 Taq 酶也很关键，首先，高保真（High fidelity）这是必须的，我在国内常用 LA KIT，可这边忑贵，只好用（美）国货。常用的是 pfu，phusion 和 pfx。

PFX50 保真性应该是目前最高的，是普通 Taq 的 50 倍，对一般基因绝无问题（我同事 4.5 K PCR 产物，居然一个突变都没有），但是对比较难 PCR 的高 GC 或者位点比较难做 PCR 的基因（基因组为模板）就明显不行了。

pfu（安捷伦）保真性没有 pfx50 高，但是能力很强，略贵点。phusion 虽不贵，但是这个酶很怪异，每次用都要把 annealing 温度调高好几度，否则就出杂带。

个人觉得 NEB 内切酶绝对是 NO.1，但是 Taq 就不如 Invitrogen 了。如果实验室有钱，直接买 Invitrogen 的 spuermix，什么都混好了，连 ddH2O 都搞定。只要直接向里加模版和引物就 OK，每次我要拿漂亮的结果都用 supermix。

还是那句话，读说明书。同是高保真 Taq 酶，iproof 要求 98 度起始 1 min，pfx 就要求 95 起始 2 min，延伸有的是 72，有的是 68，有的要加 1 μL，有的加 0.5，有的 TM 要低五度，有的高三度，这些必须要读说明书，读且仔细读，这是拿到任何试剂都要做的第一步。

如果基因太难 PCR，怎么办？

首先，DMSO 是好物，好到甚至 FISHER 的 phusion 就直接写上了 DMSO 这项，注意 3%-6%，太高 Taq 酶活性就不行了。如果 GC 太高而且片段过长的话，DMSO 也不行，GC 低的不推荐。

我做个过一个 2.8 k，GC 比高达 92% 的基因 PCR，一共做了两周。从保真性最强的 pfx 50 到普通的 promega 2xGO Taq 都试过，什么 DMSO，甘油，Biorad 的 iproof with high GC Buffer， NEB one Taq 2x Taq High GC（还带 Enhancer 的），TAKARA 的 LA 都试过，都不行。要么不出带，要么就是乱七八糟的带一起来，头晕脑涨的我都打算抹平策略了，后来从别的实验室弄来一个 clontech 的 2 GC rich kit，一次搞定。

强烈推荐这个 kit，太牛了，在别家都缴械的时候，它一锤定音。不过价格也比别家都牛，10 次反应就 130 美元，其实实验室大可以备一个，就是防备超高 GC 又长的片段。不过这个 kit 非高保真，送了三个克隆测序，各在不同部位有突变。于是我就从 A 克隆切一段接到 B 克隆上，又从 C 克隆切一段接 B 克隆上。问题是 GC 比太高测序也很困难，正常 GC 能测 1 K 左右，到了 High GC 就能测个五六百，这时要多准备些引物。

PCR 产物的纯化

如果带很单一，又强，直接 PCR 产物纯化就可以。如果有杂带，但目的带也很强，跑胶，目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈，就是回收率的问题，我试过很多家的 kit，promega 的 GEL 回收试剂盒效率和价格都很合适，推荐这个。

关于 T 载体，我在国内的时候是必用的，到了美帝反倒一次没用过。这边比较流行直接用 PCR 产物切，就是回收完了直接切上，回收后然后连接，这又回到了最开始设计，要加保护碱基。这个策略好处就是免除了 T 载体这步，直接插入目的载体，存在的问题就是处于盲做状态，还要加保护碱基。

未完待续，敬请期待。

文章作者：丁香园论坛常驻战友 shirley951951