seahorse 检测细胞能量代谢状况

使用 seahorse 仪器检测细胞能量代谢状况，具体包括细胞有氧呼吸和糖酵解。

有氧呼吸和糖酵解是细胞内两条主要的能量生产途径，前者可通过加入不同的线粒体电子传递链药物来测得细胞呼吸氧耗率，后者则通过加入寡霉素抑制有氧呼吸来测得细胞产酸率。

测量细胞能量代谢，细胞有氧呼吸情况，细胞糖酵解情况。

Seahorse XFe96 仪器；Seahorse XF 细胞线粒体压力测定试剂盒

Seahorse 细胞能量检测的实验操作在细胞类型（贴壁或悬浮）、细胞数量、药物剂量浓度上均可能会有区别，需要在实验过程中进行调整，以下为贴壁细胞的一种线粒体压力测试方案：

一、准备工作

1. 接种贴壁细胞：将细胞接种在 XF96 细胞培养板上，每孔 80 μL 培养基，细胞数在 5~20 k/well 为佳，待细胞放入培箱中培养固定 1 h 后，再向每孔加入 70μL 培养基；在背景校正孔中加入 150 μL 培养基，不加细胞；将细胞培养板放入 37 ℃ CO₂ 细胞培养箱中培养过夜；

2. 水化探针板：在水化板（Utility Plate）中加入 200 μL/孔的无菌水，再放上探针板和盖子，轻微移动排出气泡后，在 37 ℃ 无 CO₂ 细胞培养箱中过夜；同时取出至少 20 mL 的 XF 校准液放入离心管中，37 ℃ 无 CO₂ 细胞培养箱中过夜；

二、上机检测

1. Seahorse Xfe96 系统预热：至少提前 5 小时打开仪器、电脑和软件进行预热；

2. 水化探针板：次日去除探针板装置，弃去 Utility Plate 中的无菌水，每孔加入 200 μL XF 校准液，放上探针板和盖子后，在 37 ℃ 无 CO₂ 细胞培养箱中水化 45~60 min；

3. 配置检测液：配置方法按试剂盒说明书进行，并根据实验需求进行调整；简而言之，一块培养板配置约 100 mL 检测液（97 mL 103575-100 试剂盒中加入 1 mL glucose（终浓度为 10 mM）、1 mL pyruvate(终浓度为 1 mM)、1 mL glutamine(终浓度为 2 mM)），调整检测液 PH 至 7.4，然后将使用 0.22 μm 细胞滤器过滤后放入 37 ℃ 温育备用；

4. 细胞换液：弃去细胞培养板中的培养基（留下 20 μL 覆盖细胞），加入 200 μL 检测液清洗 2 遍，彻底去除检测液，再加入 180 μL 检测液，将细胞放入 37 ℃ 无 CO₂ 细胞培养箱中 60 min 等待上机；

5. 配药：从试剂盒中取出一包药物，用检测液进行稀释，具体见下表

推荐 Oligomycin 上机终浓度为 1.5 μM，Rot/AA 上机终浓度为 0.5 μM，FCCP 上机终浓度为 0~2 μM，2~3 mL 药物工作液为 10x 浓度装载入探针板，例如：想获得终浓度为 1.5 μM 的 Olygomycin，需加入 630 μL 检测液重悬，混匀后从重悬液中取出 450 μL 并加入 2 550 μL 检测液配置 3 mL 15 μM 的工作液；

6. 加药：探针板中每孔加入 20 μL 配制好的药物，加药时保持探针板水平，枪头略倾斜于探针板，枪头深入孔中但不能没入液体，药物不能挂壁；加药顺序为：（实验所需细胞药物）-Oligomycin-FCCP-Rot/AA。

7. 上机运行：根据实验设计完成组定义设置，StartRun 运行实验，按照提示将去掉盖子的探针板防止于托盘上，进行校准（约 20 min）；校准完毕后将 Utility Plate 换成细胞培养板，并开始进行细胞能量代谢测试，测量结束后点击 Eject 取出细胞培养板和探针板，并对数据进行归一化处理。

细胞状态最为重要，需要培养好细胞；贴壁细胞贴壁后细胞汇合度达 80~90% 为佳，并且细胞数量与药物浓度之间的比例需要把控好，做到能够检测到合适范围的氧耗率或产酸率，又不会过度抑制细胞活性。

1. 探针板的水化时间？

4~72 小时，建议过夜。

2. 检测液中可以加入血清吗？

不建议加入，血清会影响检测液的缓冲能力，也可能与药物发生非特异性结合而影响检测效果。

3. 溶好的药物可以使用多长时间？

药物和检测液建议现用现配。

4. 加入 FCCP 后，OCR 没有升上去？

需要考虑是否细胞活性不佳，或者 Oligomycin 加入过多抑制了最大呼吸。

5. FCCP 剂量摸索如何设置？

参考已有文献中的浓度或官网给的建议如下：