🔥 病原菌毒力测定

毒力表示病原体致病能力的强弱，构成细菌毒力的物质称为毒力因子，主要有侵袭力（病原菌在机体内定殖、突破机体防御屏障和内化作用、繁殖和扩散的能力）和毒素。

病原菌毒力的评估常常通过感染模型进行，常见的感染模型包括体外模型（细胞感染模型）及体内模型（动物感染模型）；而在非脊椎动物感染模型中，昆虫有其复杂的先天免疫系统，与哺乳动物高度相似，它们被认为是大型哺乳动物细菌毒力研究的合适替代模型。

大蜡螟（Galleria mellonella） 的幼虫是用于病原菌体内毒力测试的极佳模式生物，通过左前足或皮肤进行血腔内注射是最常见的感染途径，感染后可根据大蜡螟的活动能力、黑化情况和存活情况等建立健康评分系统，以用于评价待测病原菌的毒力。

用于体内实验评价病原菌的毒力。

大蜡螟幼虫，待测菌株，细菌液体培养基，细菌固体培养平板，无菌 PBS，可见光分光光度计，灭菌微量进样针。

病原菌毒力测定的步骤如下：

1、细菌复苏：以常见病原菌大肠埃希菌为例，将待测菌株以分区划线的形式复苏于 MH 固体培养基上过夜培养；第二天随机挑取一单菌落，接种于 2 mL MHB 液体培养基，置于 37 ℃ 摇床，200 rpm 摇菌过夜；

2、细菌培养：取摇菌过夜的细菌 1:100 接种于新鲜 MHB 液体培养基，置于 37 ℃ 摇床，200 rpm 摇菌至对数生长期；

3、使用酶标仪或分光光度计测量步骤 2 中对数生长期的细菌在 600 nm 可见光波长下的吸光度（OD₆₀₀）；

4、将菌液于 5 000 rpm 离心 5 min，弃上清，随后使用 PBS 重悬细菌并调整至 OD₆₀₀=1.0（约为 5 × 10⁸ CFUs/mL）备用；

5、将大蜡螟幼虫随机分组，每组 10 只置于培养皿中，应确保用于实验的大蜡螟幼虫长度、重量及生长状态尽量相同；

6、使用 PBS 将待测菌液再次稀释至 1 × 10⁷ CFU/mL。固定大蜡螟幼虫，暴露腹部，使用微量注射器注射 10 μL 稀释菌液（细菌感染数量为 105 CFU）至左前第一腹足，对照组注射等量 PBS；

7、将不同培养皿中的大蜡螟幼虫放置在恒温培养箱中，37 ℃ 避光培育，每 12 小时观察一次，持续观察 72 小时，记录大蜡螟幼虫的生存情况并绘制生存曲线；

8、可进行不同数量级细菌的感染试验，采用 Probit 模型，作出细菌含量与死亡情况之间的函数曲线，x 轴为细菌含量，y 轴为大蜡螟幼虫死亡比例。 根据拟合的函数曲线，在 y 轴上取值 0.5 所对应的 x 值，即为半数致死量。

1. 大蜡螟幼虫的生长发育对温度有较严格要求，可在 15 ℃ 条件下保存，感染后在 37 ℃ 恒温条件下饲养；

2. 饥饿可以降低大蜡螟的免疫反应和增强易感性，从而增加成功感染的机率，因此，通常在感染前饥饿处理大蜡螟幼虫 24 h，以利于感染模型的成功建立；

3. 通过左前足或皮肤进行血腔内注射是最常见的感染途径，口腔感染也有报道，缺点是难以控制准确的感染剂量，可通过强制喂食法进行解决，但对操作技术具有一定的挑战性；

4. 需提前明确细菌 OD₆₀₀ 与 CFU 的对应关系，具体方法为：将菌液稀释至 OD₆₀₀=1.0，并梯度稀释后涂板计数。

1. 病原菌感染剂量及观察时间如何确定？

建议参考文献，不同毒力背景的细菌所需的感染剂量差异较大，可在 104~106 CFU 之间进行梯度预实验，以确定最佳细菌感染剂量和观察时间间隔。

2. 实验过程中，对照组如何设置？

除了使用 PBS 注射作为阴性对照外，还可以根据待测菌株的类别，选择同种属细菌的高毒力、低毒力菌株作为对照，以评估待测菌株的毒力强弱。