外周造血池动员的CD34NEG造血前体细胞表型和功能分析实验

外周造血池动员的 CD34^NEG 造血前体细胞表型和功能分析是在无血清培养条件下，研究原始 CD34^NEG CD38^NEG LIN^NEG 细胞和CD34⁺ CD38^NEG LIN^NEG 细胞增殖状态过程中 CD34 抗原表达调变的实验。

外周造血池动员的 CD34^NEG 造血前体细胞表型和功能分析是从外周造血池动员的细胞中纯化静止的原始 CD34⁺ 和 CD34^NEG 细胞。与其他来源的 CD34^NEG 细胞不同，外周造血池动员的细胞来源的 CD34^NEG 细胞容易在无基质细胞培养液中生长，易于分析。利用谱系抗原清除后低密度单个核细胞组分，通过细胞分选纯化得到 CD34^NEG CD38^NEG LIN^NEG 和 CD34⁺ CD38^NEG LIN^NEG 细胞。将细胞培养于含早期活化细胞因子的无血清培养液中 40 h，可以观察到 CD34 抗原表达上调和下调情况。

器材：

① 绿色磁铁（目录号 11 055）和绿色磁架（目录号 11 056）；

② 直径 1.27 cm 的分离柱（目录号 12 052）或直径 1.524 cm 的分离柱（目录号 12 056）；

③ Rainin Dynamax 泵（RP-1 蠕动泵，Rainin Instrument Co.，Inc.，温本，马萨塞州）；

④ 新鲜或冻存的 MOPB 细胞。样品必须含细胞≥4x108MNC（起始细胞数高有利于后续的实验）；

⑤ 流式细胞仪必须备有发射 488 nm（FITC，PY，PE，和 PE-CY5）和 633 nm（激发别藻蓝蛋白，APC）2 个激光器。

试剂：

① Iscove's modified Dulbecco's 培养液（IMDM）（卡尔斯巴，加州，目录号 12 440-053）；

② 无血清扩增培养液（SFEM）（温哥华，不列颠哥伦比亚，加拿大，目录号 9 650）；

③ 热灭活胎牛血清（HIFBS）；

④ 细胞因子：rhSCF，rhFlt3 Ligand（rhFL），rhIL-3，rhIL-6，和 rh-TPO；

⑤ 无菌 10 × 磷酸盐缓冲液（PBS），无钙、镁离子（目录号 14 200-075），用无菌蒸馏水稀释到 1X；

⑥ DNA 酶（牛胰腺脱氧核糖核酸酶 I）（圣路易斯，密苏里州，目录号 2025)；

⑦ 淋巴细胞分离液（皮斯卡特维，新泽西州）；

⑧ 氯化铵-EDTA（目录号 7 850）；

⑨ StemCell Technologies 公司生产的免疫磁性分离用无荧光抗体：用于磁性分离细胞组份的谱系清除的试剂（人祖细胞富集组合抗体，目录号 14 056），由针对血型糖蛋白 A（GlyA）、CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56 和 CD66b 的抗体组成，包含磁性胶体以及必须的 CD41 四聚体抗体复合物（目录号 14 050）；

⑩ BD 生物科学部（圣何塞，加州）荧光抗体：FITC 标记抗体：CD3、CD7、CD14、CD16、CD19、CD20、CD42a 和 CD56（CD7 和 CD42a 抗体已经包含在谱系混合试剂中，目录号 340 546），另外，还需要 CD38-APC、Ki67-FITC 试剂盒（BD Biosciences，＃556 026）和合适的同型对照抗体；

⑪ 贝克曼-库尔特公司（迈阿密，佛罗里达州）荧光抗体：GlyA-FITC、CD34-PE-CY5（clone 581，class III）和同型对照抗体。还需要下列 PE 标记抗体：GlyA、CD4、CD14、CD16、CD19、CD20、CD41 和 CD56，每种抗体加 100 μl 混合成单一「LIN-PE」试剂，4 ℃ 条件下贮存在黑瓶中。每管加 25 μl 混合试剂作为细胞分析用，同样需要合适的同型对照抗体；

⑫ 细胞固定/细胞破膜；试剂盒（目录号 554 714）；

⑬ 青霉素＋链霉素溶液，10000 U（目录号 15 140-122）；

⑭ 低密度脂蛋白（LDLs）（目录号 L2 139）；

⑮ Immuno-Brite 质控珠（目录号 6 603 473）；

⑯ 多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich）；

⑰ 派若宁 Y（PY）（Sigma-Aldrich）；

⑱ Hoechst 33 342（HO）（Sigma-Aldrich）；

⑲ 过夜存储培养液（OSM）：10 ml 含有 100 μl 的青霉素/链霉素的 SFEM，20 μl 的 LDL；

⑳ 10 ng/ml 的 flt3 配体（FL），10 ng/ml 的干细胞因子（SCF）；

㉑ DNA 酶洗涤液：100 ml 含有 1 mg DNA 酶的无菌 PBS，1％ 青霉素/链霉素，2％ HIFBS。当天新鲜配制使用；

㉒ 补充 SFEM：SFEM 中含有 1％ 牛血清白蛋白、10 μg/ml 胰岛素、200 μg/ml 人转铁蛋白（铁饱和）、10^-4 M 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酸盐的 IMDM 中补充 50 ng/ml rhSCF、50 ng/ml rh-FL、12.5 ng/ml rhIL-3、10 ng/ml rhIL-6、100 ng/ml TPO 和 1：200 LDL；

㉓ 多聚甲醛（PFA）：每月用 4％ 多聚甲醛 PBS 溶液稀释到 1％ 浓度。细胞固定时再稀释 2~5 倍；

㉔ PBS 胎牛血清（PBSFB）：含 2％ HIFBS 和 1％ 青霉素/链霉素的 1 × PBS；

㉕N-（α-羟乙基）嗪-N'-（α-乙磺酸）（HEPES）缓冲液：pH7.2，含 20 mM HEPES，1 g/L 葡萄糖和 10％HIFBS 的 Hank's 平衡盐溶液，4 ℃ 储存；

㉖ HO：储存液为 1.6 mM，过滤除菌，4 ℃ 避光保存。染料的使用当天：用 HEPES 缓冲液将储存液做 1：1 000 稀释至 1.6 μM，避光置于冰上；

㉗ PY：储存液为 100 μg/ml，过滤除菌，4 ℃ 避光保存。染料的使用当天：用 HEPES 缓冲液稀释储存液至 10 μg/ml，避光置于冰上。

外周造血池动员的 CD34^NEG 造血前体细胞表型和功能分析实验基本过程可分为以下几步：

（一）复苏细胞的初始准备

A. 将样品快速置于 37 ℃ 水浴中。用等体积的含 20％HIFBS 冷 IMDM 缓慢稀释样品，并不断混合，于室温 300 g 离心 10 min。

B. 弃上清液，用 30 ml 室温的 DNA 酶洗涤溶液洗涤细胞。弃上清液，将细胞均匀重悬于 10 ml DNA 酶洗涤液。

C. 在 15 ml 试管中，将细胞悬液加到 5 ml 的 Ficoll-Paque 分离液表面。于室温 300 g 离心 25 min。收集低密度的 MNC 带，放入 50 ml 试管中，加入 DNA 酶洗涤溶液，离心洗涤 2 次。在室温用 400 g 离心 15 min，把细胞的损失降到最小（对新鲜和冻存细胞用同样的洗涤液）。

D. 尽可能去除上清液，加 15 ml 氯化铵-EDTA 到沉淀中，混匀后置于室温 10 min，溶解残存的红细胞。试管中加满 PBS，室温 300 g，离心 10 min。用 DNA 酶洗涤液洗涤，在最后 1 次洗涤之前，取出一小部分做细胞计数（决定最后 1 次加上清液的量）。

E. 用 DNA 酶洗涤液重悬细胞至浓度为 6 × 10⁷/ml［每个分离柱容许的细胞浓度范围为（2~8）× 10⁷/ml］。

（二）免疫磁分离去除 LIN⁺ 细胞

A. 第 1 次孵育：每 1.0 ml 细胞悬液加 100 μl 人造血祖细胞富集组合抗体试剂。同样在细胞悬液加抗-CD41 至浓度 10 μl/ml。冰上孵育 30 min。

B. 第 2 次孵育：不要洗涤，每 1.0 ml 细胞悬液加 60 μl 磁性胶体。接着再次冰浴 30 min，不要洗涤细胞。

C. 分离系统是通过去除 LIN⁺ 细胞来富集 LIN^NEG 细胞，其包括磁铁、分离柱、支架和合适的抽吸泵。绿色磁铁可用重力荷载或泵载细胞，其他磁铁按较少量细胞重力流入或单个或多个泵分离而设计。厂商推荐 5 × 10⁷ 到 5 × 10⁸ 细胞适用 1.27 cm 的分离柱，1 × 10⁸ 到 2 × 10⁹ 细胞适用 1.524 cm 的分离柱。使用的分离柱如果太小，细胞纯度受影响；而使用太大的分离柱，获得的细胞产量将下降。

D. 在层流超净工作台内，在磁铁的间隙中放下分离柱（不要从前面插入）。预先准备好分离系统：从分离柱上方向底部缓慢泵入无菌 PBS 直至完全浸没柱充填质（1.27 cm 的分离柱，泵装置设定为 1.5 或 1.524 cm 的分离柱，泵装置设定为 3.0）。剧烈叩击分离柱的一侧，除去气泡。让无菌 PBS（1.27 cm 的分离柱用 15 ml，1.524 cm 的分离柱用 25 ml）从分离柱顶端流入，用废液管收集废液。不要让 PBS 的液面降到充填料下面。用无菌收集管（50 ml 离心管）替代废液管。把细胞胶体悬液加到分离柱的顶端，1.27 cm 的分离柱泵速为 5.0（1.524 cm 的分离柱为 10.0）。LIN^NEG 细胞将出现在柱洗出液中。

E. 为了捕获所有 LIN^NEG 细胞，用 3 倍柱体积的 DNA 酶洗脱液流柱，收集柱洗出液。合并柱洗出液进行活体细胞计数。

F. 合并的柱洗出液于室温 300 g 离心 10 min，去上清液，细胞重悬于 10 ml OSM 中。在 T25 培养瓶中（不做任何处理增加细胞黏附能力），37 ℃ 5％ CO₂ 湿度培养箱中孵育过夜。在这些条件下，能够保持细胞的活性，也不会刺激细胞增殖。

（三）分离原始 CD34^NEG 和 CD34⁺ 细胞

A. 过夜培养后，计数获得的瓶中细胞悬液中的活细胞数（平均能从开始的 4 × 10⁸ MoPB 标本中获得 10⁷ 个细胞）。

B. 除 LIN 细胞的扩增。这些细胞将在后续的实验中用作阳性对照（见小标题 3.5.1）。

C. 从 T25 培养瓶中收获的去除 LIN 细胞置于含无菌 PBS 的 15 ml 试管中，于室温 300 g，离心 10 min。

D. 用 0.5~1.0 ml 的 PBSFB 重悬细胞，取出部分放在一个试管中，用于抗体标记。根据实验室自身经验，利用剩余的细胞建立分选对照。每个试管中加 2.0 ml 的 PBS，4 ℃ 300 g 离心 10 min。保留 200 μl 上清，弃去其他部分，将细胞重悬于上清液中。

E. 在这一步中，将待分选的细胞标记针对 CD34、CD38、LIN 抗原抗体。以 FITC 标记抗 CD3、CD14、CD16、CD19、CD20 和 CD56 的商业化 LIN 抗体组合，添加 FITC 标记抗 CD42a、CD7 和 GlyA 抗体来作为标记谱系抗原抗体组合。每 1 × 10⁶ 细胞加 12 μl LIN-FITC 组合和 GlyA-FITC、CD7-FITC 和 CD38^- APC 各 15 μl，再要加 10 μl CD34-PE-CY5 和 CD42a-FITC。设置适当的同型对照，冰上避光孵育 30 min。4 ℃，用 PBSFB 洗涤细胞 2 次。将细胞重悬于 PBSFB 中，至分选合适的细胞浓度。避光、冷保存细胞。

F. 在完成流式细胞仪的内部质量控制操作后，再行同型对照标本上机。用少量标记细胞上样，为分选 CD34^NEG CD38^NEG LIN^NEG 细胞和 CD34⁺ CD38^NEG LIN^NEG 细胞设门。为最有效地纯化无 CD34、CD38 和 LIN 抗原的细胞，选择包含荧光强度最弱的 1/3~1/2 抗原阴性细胞群区域保守设门。较宽松的设门增加了产量但却降低了细胞纯度。

G. 分选去除 LIN 的细胞悬液，得到 CD34^NEG CD38^NEG LIN^NEG 细胞和 CD34⁺ CD38^NEG LIN^NEG 细胞组分。在整个操作过程中，始终要保持分选前细胞悬液和分选后的 2 个细胞组分处于低温状态。

H. 对分选后活细胞进行计数。

I. 取从分离的 CD34⁺ 和 CD34^NEG 细胞组分进行步骤 10 实验。大约 1 × 10⁴ 个细胞。把剩余的纯化细胞移到 24 孔板中，并补充 SFEM，置 37 ℃ 5％ CO₂ 湿度培养箱培养。最初的细胞培养浓度应＜5 × 10⁴/ml。

J. 用 PY 掺入或 Ki67 表达分析刚分选到的组分。因为刚分选到的细胞是处在静止期的，是属于 PY^LOW 或 Ki67^NEG 的细胞群。标本同样可以用 CD34，CD38 和 LIN 重新染色，以分析细胞纯度。

K. 当分选结束，不改变任何电压设置，再将第 2 或第 3 号 Immuno-Brite 珠上样。这将为后期 Ki67 分析提供了参考的荧光强度。

（四）分选细胞培养前、后免疫标记染色和增殖状态分析

A. 如果细胞培养 2 d 或更长，可利用的细胞数量少且变化量大。如果可能，从培养的 CD34^NEG 细胞中取出（1~4）x10⁴ 个细胞，从 CD34⁺ 细胞中取出 2 × 10⁵ 个细胞，从去除 LIN 的细胞组分中取出 4 × 10⁵ 个细胞。各自用 PBS 洗涤，并用 PBS 重悬细胞。

B. 标记 A~D4 个试管用于已去除 LIN 抗原的培养细胞作为对照细胞。同样标记：E⁺、E^NEG、F⁺、F^NEG（分别用于 CD34⁺ 细胞和 CD34^NEG 细胞各 2 支）4 个试管和 1 个 G 管（Immu-no-Brite 磁珠），一共 9 个试管：

A = 测定自发荧光的未染色标本。

B = 单独的 Ki67-FITC（阳性对照）。

C = 单独的 LIN-PE（阳性对照）。

D = 单独的 34-PE-CY5（阳性对照）。

E⁺ 和 E^NEG = 同型对照-PE-CY5，同型对照-APC，同型对照-PE 和同型对照-FITC（E⁺ 用于 CD34⁺ 培养细胞，E^NEG 用于 CD34^NEG 培养细胞）。

F⁺ 和 F^NEG = Ki67-FITC、LIN-PE、34-PE-CY5、38-APC 测定抗体（F⁺ 用于 CD34⁺ 培养细胞，F^NEG 用于 CD34^NEG 培养细胞）。

G = Immuno-Brite 珠。

C. 在 A、B、C 和 D 试管中加入去除 LIN 组分的 1 ×10⁵ 个细胞。而 E 和 F 管，根据实验室内部参考指标用尽可能最少的细胞量。例如，在 E⁺ 和 E^NEG 试管中加入 ≥ 1 × 10⁴ 个培养的 CD34^NEG CD38^NEG LIN^NEG 细胞和 ≥ 1 × 10⁴ 个培养的 CD34^NEG CD38^NEG LIN^NEG 细胞。重复上述内容，在 F⁺ 和 F^NEG 管中加入同样量和种类的细胞。

D. 对于试管 A 和 B，洗涤细胞，用 0.5~1.0 ml 的 PBSFB 重悬细胞，避光冰浴保存。

E. 对于试管 C~F，按实验室内部的细胞外抗原标准的方法，用标明的单克隆抗体染色。C 和 D 试管在最后 1 次洗涤后，用 0.5~1.0 ml 的 PBSFB 重悬细胞。冰浴保存。E 和 F（和 B）试管在最后 1 次洗涤后，直接进入步骤 F。

F. 试管 B、E⁺、E^NEG、F⁺ 和 F^NEG 内细胞的固定和破膜用于 Ki67 染色，步骤如下：

G. 用 250 μl 细胞固定/破膜溶液重悬试管 B、E⁺、E^NEG、F⁺ 和 F^NEG 中洗涤过的细胞。避光 4 ℃ 孵育 20 min。在这 20 min 期间，用蒸馏水 1：10 稀释破膜/洗涤缓冲液。

H. 4 ℃，用稀释过的破膜/洗涤缓冲液洗涤试管 B、E⁺、E^NEG、F⁺ 和 F^NEG 2 次。在第 2 次离心后，移去上清，只留下剩余的 50μl 破膜/洗涤缓冲液，重悬细胞。

I. 在试管 B 和 2 支 F 试管内加 20 μl Ki67-FITC（实验管）。2 支 E 试管内加 10 μl 同型对照-FITC（对照管）。暗处冰上孵育 30 min。

J. 用稀释过的破膜/洗涤缓冲液洗涤试管 B、E⁺、E^NEG、F⁺ 和 F^NEG 两次，用 PBSFB 重悬细胞待流式分析。在进行胞内染色过程中，试剂说明书要求细胞必须保存在含皂素（破膜/洗涤）的缓冲液中。

K. 样本在 24 h 内测定，Calibrate 流式细胞仪首先用试管 G Immuno-Brite 珠设置到前述介绍的最高通道值。

L. CD34、CD38、LIN，和 PY 表达细胞染色。

M. 使用当天：稀释 HO/HEPES 缓冲液：10 μl HO 储存液加入 10 ml HEPES 缓冲液。稀释 PY：10 μl 贮存液 PY 加入 90 μl HEPES 缓冲液。

N. 这部分介绍细胞的收集与分类。因为和小标题 3.5.2 介绍的方法有明显操作程序上的不同，4 份细胞分为样品 1~4。如上所述，可利用的细胞数量少且可变化量大。

O. 细胞培养 2 d 或更多，从 CD34^NEG 细胞培养物中取出（1~4）× 10⁴ 个细胞（作为「样品 1」），从 CD34⁺ 细胞培养物中取出 2 × 10⁵ 个细胞（作为「样品 2」），从去除 LIN 培养物中取出 1 × 10⁵ 个细胞（作为「样品 3」）。每管用 PBS 洗涤，用 1.5 mL 稀释过的 HO/HEPES 缓冲液重悬细胞。3 个试管盖上盖子，不要旋紧，立即置于 37 ℃ 5％ CO₂ 湿度培养箱培养 45 min。这是 PY 染色的第一步（下一步是下面的步骤 6）。

P. 从培养的去除 LIN 组分中取出 3 × 10⁵ 个细胞（作为样品 4），用 SFEM 加到 2 ml 体积，存于冰上。

Q. 标记 4 支试管 A～D，用来测定去除 LIN 培养液中的对照细胞，同样标记 4 支试管 E⁺、E^NEG、F⁺ 和 F^NEG（CD34⁺ 细胞 2 支，CD34^NEG 细胞 2 支）。一共 8 支试管：

A = 未染色细胞（测定自发荧光）。

B = 单独的 PY（阳性对照，PY 没有实质上的阴性对照）。

C = 单独的 Lin-FITC（阳性对照）。

D = CD34^- PE-CY5（阳性对照）。

E⁺ 和 E^NEG = PY 和同型对照-PE-CY5、同型对照-APC 和同型对照-FITC。（E⁺ 用于 CD34⁺ 培养细胞，EN 用于 CD34^NEG 培养细胞）。

F⁺ 和 F^NEG = PY 和实验用的 LIN-FITC、CD34^- PE-CY5、CD38^- APC 测定抗体（F⁺ 用于 CD34⁺ 培养细胞，F^NEG 用于 CD34^NEG 培养细胞）。

R. 样品 1~3 在 37 ℃ 条件下完成最初 45 min 孵育后，每一试管加 15 μl 稀释的 PY（终浓度为 0.1 μg/ml）。再盖上盖子，不要旋紧，立刻放回 37 ℃ 5％ CO₂ 湿度培养箱再培养 45 min。

S. 从培养箱中取出样品 1~3。这样现在就有 4 群细胞：3 种染 PY（步骤 3 和 6）和冰上的样品 4（步骤 4）。这 4 个样品分到 8 个试管中。

T. 样品 1，取出 1/3 CD34^NEG 细胞转移到 ENC 试管，2/3 加到 F^NEG 试管。用 1.5 ml HEPES 缓冲液洗涤细胞 2 次。用 200 μl PBS 重悬细胞。

U. 样品 2，取出 1/2 CD34⁺ 细胞加到 E⁺ 试管，另 1/2 加到 F 试管。用 1.5 ml HEPES 缓冲液洗涤细胞 2 次。用 200 μl PBS 重悬细胞。

V. 样品 3，用 1.5 ml HEPES 缓冲液洗涤细胞 2 次。用 1.0 ml PBSFB 重悬细胞。避光置于冰上。这样试管 B 完成了所有操作步骤。

W. 样品 4，将细胞平均分到试管 A、C、D，并用 PBS 洗涤细胞 2 次。用 1.0 ml PBSFB 重悬细胞 A，置于冰上。用 200 μl PBS 重悬细胞 C 和 D。这样试管 C、D、E⁺、E^NEG、F⁺ 和 F^NEG 细胞已经为细胞外抗原染色做好准备了。

X. 按细胞外抗原染色标准方法，用标明的 LIN-FITC，CD34^- PE-CY5，CD38^- APC 或合适的同型对照单克隆抗体对试管 C、D、E⁺、E^NEG、F⁺ 和 F^NEG 细胞染色。

Y. 上机分析或加 1％ 多聚甲醛待后上机分析。