通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞

通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞，是基于一种重要染料 Hoechst 33342 可被干细胞泵出的特征，从小鼠骨髓分离出造血干细胞。目前，通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞采用流式细胞术。

通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞的基本原理是通过同时检测一种荧光染料的两种发射波长来定义一个细胞亚群「边缘群」，从而检测小鼠骨髓和人脐带血中目的造血干细胞。

器材：流式细胞仪、剪刀，咬骨钳，注射器，针头，镊子，80um 滤器/筛网、已消毒的组织培养器皿、血球计数仪、水浴箱、冷冻离心机。

试剂：

①70% 乙醇；

②缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）或 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）和 2%（v/v）胎牛血清（FBS）；

③培养基：高糖 DMEM, 含 2%（v/v）的 FBS 和 10 mM 的 HEPES；

④人脐带血分离单个核细胞所需溶液: 抗凝剂

⑤红细胞裂解液：154 mM 氯化铵，10 mM 碳酸钠或钾,0.082 mM 的 EDTA 四钠。

⑥ Hoechst 33342：准备 1 mg/mL 的储存液，用蒸馏水溶解。

⑦维拉帕米（Sigma）：蒸馏水配制成 5 mM 储存液。4℃ 保存。

⑧烟曲霉素 C（FTC）：用 DMS0 配制成 10 mM 储存液，-20℃ 保存。

⑨碘化丙嚏（PI）：去离子水配制成 lmg/mL 储存液，4℃ 避光保存。

通过边缘群细胞表型检测和富集造血干细胞的实验步骤如下：

（一）小鼠骨髓和人脐带血细胞的准备和分离

按规定的方法无痛苦处死小鼠。

A. 用 70% 的乙醇消毒后置于实验台上。

B. 用已消毒的外科器械在腹部正中剪一个横切口，去除后肢及臀部皮肤。

C. 从髄关节处游离后肢，去除足掌, 置于装有缓冲液的器皿中。

D. 剔出股骨和胫骨上肌肉组织，转入新的含有缓冲液的器皿中。

E. 分离股骨和胫骨，去除骨的两端。

F. 将股骨和胫骨转入新的含有缓冲液的器皿中，用 4 mL 缓冲液轻轻地从骨的两端冲洗出骨髓。

G. 将细胞悬液吸出放进 10 mL 试管中，用新的缓冲液清洗器皿确保回收所有的细胞。

H. 细胞悬液用 80pjn 的筛网过滤去除细胞团块。

（二）人脐带血单核细胞的分离

A. 用室温、无菌、含有 0.6%ACD-A 或 2 mM EDTA 的 PBS 按 1：3 比例稀释已抗凝的脐带血。

B. 在 50 mL 管中放入 12 mL Ficoll-Paque, 然后在上面缓慢加入 35 mL 已稀释的脐带血。

C.20℃,375 g，水平转子离心 30 min。

D. 吸出上层清亮液体层至单核细胞层（交界处一白色薄层）。

E. 用 10 mL 吸管将细胞层转移至一个 50 mL 管中（每管约 20 mL）。

F. 用室温含有 0. 6% ACD-A 或 2 mM EDTA 的 PBS 将每管补足至 50 mL,20℃,375 g 离心 15 min。

G. 用 10 mL 红细胞裂解液重悬细胞（充分混匀），然后补足至 50 mL。

H. 室温静置 l0 min 后,20℃,375 g，离心 15 min。

I. 用 20 mL 室温 PBS 洗涤细胞,375 g 离心 15 min。然后用预热的培养液重悬细胞。

（三）Hoechst 33342 的细胞染色

A. 将水浴箱设定为 37℃，预热培养液。

B. 计数有核细胞的数目，用培养液将细胞悬为 1x106/mL。

C. 向细胞悬液中加入 Hoechst 33342 储存液，终浓度为 5ug/mL。

D. 将细胞/染料悬液置于合适的试管，没入水浴箱中。容积 1-3 mL 用 5 mL 管，容积 4-10 mL 用 15 mL 管，更大体积用 50 ml 管。一定要使细胞悬液上层液面完全没入水浴箱中。以确保样品在 37℃ 均匀受热

E. 水浴 90 min, 每 20 min 轻轻颠倒混匀 1 次以免细胞沉淀和结块。

F.375 g,4℃ 离心 6 min（离心机转子预冷），用适量预冷的缓冲液重悬细胞。

（四）运用流式细胞仪检测 SP 细胞

A. 安装 450/20 带通滤光片用于检测 Hoechst 蓝,675 长带通滤光片检测 Hoechst 红,610 短波带通二色棱镜用于区分蓝光和红光信号。

B.UV 激发的 PI 荧光也能被 675 长波带通滤光片检测到。但是,PI 阳性的死细胞荧光强度很高，很容易和活细胞上的 Hoechst 红区别开。

C. 建立以下二维点图（X 轴和 Y 轴），所有的参数都用线性模式：前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。 Hoechst 红和 Hoechst 蓝。

D. 分析时样品低温避光保存。

E. 上样，同时观察 FSC 和 SSC 点图，调整两参数电压，直到所有细胞在二维点图中都能显示。

F. 调节 Hoechst 红和 Hoechst 蓝参数的电压使 Hoechst 33342 着色强的细胞在二者的二维点图中可见。继续提高电压，使 Hoechst 33342 着色弱的细胞在点图左下方显示出来。

G. 收获 100 000 到 500 000 个细胞。

H. 在 Hoechst 红和 Hoechst 蓝的非线性点图上显示 SP 群体。SP 细胞是点图左边的离散群体，它在这两个发射波上荧光强度都很低。