高效液相色谱法测定植物的内源激素含量

植物内源激素对植物的生长发育起着极其重要的调控作用，极微量就表现出明显的生理作用。但由于植物体内源激素浓度很低，而且植物体成分复杂，干扰组分多，分离时易被破坏，给激素的分析测定工作带来许多困难。

酶联免疫法检测植物内源激素灵敏度高但重复性较低，高效液相色谱法适用于多类不同性质化合物的测定和分离，具有灵敏度高，选择性、重复性好及分析速度快等特点，是较为理想的植物内源激素分析方法。本实验介绍生长素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素（ZR）和脱落酸（ABA）四种激素的提取和测定方法。

高效液相色谱法在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，具有高压、高 速、高效、高灵敏度等优点。色谱仪中的分离系统包括固定相和流动相，溶于流动相的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱程度不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，进入检测器进行检测。

材料：

小麦或水稻等植物叶片

试剂：

100% 甲醇（色谱纯）、80% 甲醇（分析纯）、石油酷、乙酸乙酯、生长素、赤霉素、玉米素、脱落酸标准品

器材：

Agilent 1200 液相色谱仪、研钵、布氏漏斗、旋转蒸发干燥器、分液漏斗、滤纸、微 量注射器、0.45 μm 微孔滤膜

高效液相色谱法测定植物的内源激素含量的基本过程可分为如下几步：

1. 试验材料的处理：

称取 1~2 g 样品，在冰浴下研磨成浆，加入 80% 的预冷甲醇 20 mL，保鲜膜密封，在 4 °C 冰箱里冷浸过夜。浸提液抽滤，10 mL 甲醇润洗研钵 2 次，过滤后与浸提液合并，40 °C 下减压蒸发至没有甲醇残余。剩余水相完全转移到三角瓶中。

用 30 mL 石油醚萃取脱色 2 次，弃去醚相。加 0. 01 g PVPP（交联聚乙烯毗咯烷酮），超声 30 min，抽滤用 30 mL，乙酸乙酯萃取 3 次，合并酯相，40 °C 下减压蒸干。用甲醇（色谱纯）溶解残渣并定容至 2 mL，经 0.45 微孔滤膜过滤得待测液，保存于 4 °C 冰箱中。

2. 将色谱仪启动，步骤如下：

（1）打开电脑和色谱各个模块的电源。

（2）双击桌面「仪器一联机」，进入联机界面。

（3）手动旋开泵处冲洗阀，右键单击「泵」图标，调节流速为 5 mL · min-1，打开所有泵，系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止（一般为 5~10 min），切换通道继续遊物生理学宴验指导冲洗，直到所有要用通道无气泡为止，设流速为 0 mL · min -1，手动旋紧冲洗阀。

（4）点击「方法」一「新建方法」，创建新的方法。右键单击「泵」图标，按照方法要求选择合 适比例的流动相，设流速：1.0 mL · min -1 右键单击「检测器」图标，波长设置为 254 nm，打开检测器，待基线稳定后约 10 min 即可正式测定。

3. 测定

（1）标准曲线的绘制：取一定量生长素、赤霉素、玉米素和脱落酸标准品，用甲醇（色谱纯） 溶解，配制成不同浓度的溶液，点击「运行控制」菜单，选择「运行方法」，手动或自动进样器进样 10~30 ptL，进行液相检测分析。在一定浓度范围内，四种激素峰面积与浓度呈良好的线性关系时，即可绘制标准曲线。

（2）测定：取同样量的待测样品，进样。待样品峰全部出完后，冲洗 30 min 即可做下一个样品。

（3）定性：样品中与标准品保留时间相同的峰，即为样品的激素峰。

4. 得到所有样品色谱图后，可关机。关机步骤如下：

（1）关机前，用甲醇充分冲洗系统大约 30 min（色谱柱最终应保存在甲醇或乙睛中）。

（2）退出化学工作站，关闭各泵及其他窗口，关闭计算机。

（3）关闭液相色谱仪各模块电源开关。

5. 通过样品的峰面积以及标准曲线，计算出样品中各激素的含量。

1. 柱压上限：建立的液相方法其柱压上限应小于 3800 psi。

2. 流动相的使用：任何流动相必须用 0.45 μm 滤膜抽滤两遍，其 pH 及流动相的选择必须在色谱柱允许范围内。

3. 样品的处理：样品进样前必须过 0.45 μm 的滤膜，其 pH、分子量大小、在流动相中的溶解性及纯度必须符合要求。