体细胞核移植

动物细胞核移植（nuclear transfer／nuclear transplantation）是指通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核放入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内，形成一个新的核质重组体，重组体经过分裂、分化，并在母体内发育成一个新的个体。

细胞核移植依据供体细胞的来源不同，可分为胚胎细胞核移植（embryonienuclear transfer），胚胎干细胞核移植（embryonie stem cell nuelear transfer）和体细胞核移植（somatie cell nuclear transfer）。

无论是胚胎细胞核移植还是体细胞核移植，依据移植次数又可分为原代核移植和继代核移植。继代核移植（multiple generation nurlear transfer），又称为连续核移植（serial nuclear transfer）或再克隆（reeloning），是指用核移植得到的胚胎细胞作为供体细胞再次核移植，所得到的胚胎称为第二代核移植胚胎。

通过此方法可以得到多代的核移植胚胎，其中用胚胎细胞或体细胞进行的核移植称为原代核移植，以后各代的核移植称为继代核移植。进行动物克隆时，经胚胎分割产生的克隆个体数十分有限，于是细胞核移植成为生产克隆动物的有效方法，人们也往往把细胞核移植技术称为动物克隆技术。

细胞核移植的原理是：来源于同一胚胎的所有细胞核都含有与受精卵完全相同的遗传信息，从基因组成上具有与受精卵一样的指导个体发育的全部潜能。然而，随着胚胎的发育与细胞的分化，细胞核的某些基因组发生了变化，导致这些基因组不能恢复到从前的状态，从而丧失了核的全能性。但是他们包含着生物体的全部遗传信息，并在特定环境因素的调节下，可恢复受精卵一样的状态，并从头开始发育成一个完整的生物个体。

器材：

⑦细胞培养箱

试剂：

1．核供体细胞的准备 供体细胞类型以及所处的周期、状态都会影响核移植的成功率。可以作为供体的细胞类型有：发育早期的胚胎细胞卵裂球、胚胎干细胞、经过培养的胎儿皮肤成纤维细胞，甚至成年动物多种组织来源的体细胞等。

2．受体卵母细胞的去核

（1）盲吸法：用微细玻璃管在第一极体下盲吸，吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围部分细胞质。通常，采用盲吸法去核卵母细胞的时间应尽可能选择在刚排出第一极体时，对于IVM的牛卵母细胞而言，一般是在IVM后18-20小时。

（2）半卵法：将卵母细胞切为两半，去掉含有极体的一半，然后用不含极体的一半进行核移植。具体操作方法为：将卵母细胞移人35 mm含有PBSA的培养皿中，分两步分割透明带，即先在透明带上切一小口，然后用另一切割针扩大切口，从而分割透明带。

透明带被切割后，转移到含有PBSA和5 μg／ml细胞松弛素B的35 mm培养皿中作用3～5分钟，然后用固定针固定，分割针进入透明带的卵周隙口中，并将该针固定在靠着透明带的地方，缓慢吸取卵母细胞液。

当吸取一半卵母细胞液后，将分割针靠着透明带切割边缘轻微擦过，以达到完全分割，将针中的卵母细胞液移人准备好了的空透明带中，并用Hoechst33342染色，荧光显微镜下观察，不发荧光的作为受体卵母细胞。

（3）离心去核法：用离心的方法可使没有透明带的卵母细胞核被甩向一侧而最后脱离卵母细胞。

（4）荧光引导去核法：先用Hoechst33342对卵母细胞染色，然后在荧光显微镜下确定核的位置，去核后再观察吸去的细胞质或去核后的卵母细胞是否含有细胞核，以保证去核成功率。

（5）末期去核法：把卵母细胞激活后使之处于MII期的末期，在排出第二极体时，就可移去其下方附近的染色质和周围的少量细胞质。

（6）化学诱导去核法：1993年，Fulka等用etoposkle和放射菌酮处理处于第一次减数分裂中期的小鼠卵母细胞，处理后的染色体相互紧密结合，不易分开，形成染色体复合物，此后染色体复合物随第一极体一起排出，这样可使卵母细胞去核成功率达90％。

（7）切割去核法：先用植物凝集素（PHA）处理卵母细胞，使排出的第一极体与卵母细胞黏附在一起。

用链霉蛋白酶消化卵母细胞以去掉透明带，再在含细胞松弛素B的操作液中沿极体与卵母细胞相交切线平行方向将卵母细胞一切为二，去掉黏附极体的这一半卵母细胞。把两个无极体的半卵和一个供体细胞放在一起电融合来完成核移植

（8）高渗处理示核法：用3％ 的蔗糖处理小鼠卵母细胞，由于溶液的渗透压改变，使染色体所在区域的折光性发生改变，可以很清楚地在普通倒置显微镜下观察到核的位置，准确地去核。

（9）功能性去核法：将卵母细胞用DNA特异性Hochest染色，然后用紫外线照射，使DNA断裂失活，但长时间的紫外线照射会降低卵母细胞的活力。

3．核移植 根据供体细胞核移入部位的不同，可分为带下注射和胞质内注射两类。

（1）带下注射：将核供体放在操作液滴中，用一直径接近卵裂球大小的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球或细胞，沿着去核时在卵母细胞透明带上留下的切口注入卵周隙中，并使供体细胞与卵质膜接触。

在吸取供体细胞时，要保证细胞膜的完整性，以便供体细胞膜与卵母细胞质膜的黏合和随后的融合。

（2）胞质内注射：用直径为5-8 μm的注射针将细胞核直接注入卵母细胞质内，一般沿去核时留下的口进入 操作的环境温度为30-35 ℃。

4．细胞融合 带下注入的卵母细胞重构胚必须经过融合处理，使供体细胞核进入受体细胞质中形成重构胚。根据细胞融合方法的不同，可以分为以下几种。

（1）病毒介导的融合：多种病毒都可以介导细胞融合，其中在动物细胞融合中较常用的是仙台病毒。灭活的仙台病毒可附着于细胞膜上，使细胞接触部分的膜破坏，形成通道，从而两细胞的细胞质融合。

将供体细胞和2500～2600血凝单位（HAU／ml）的仙台病毒溶液一同注射到透明带下，重构胚可以在15～30分钟内融合、此方法对胚胎发育有影响，易发生污染，且对某些物种无效，故较少使用。

（2）化学融合：PEG介导的细胞融合，其作用过程是先使细胞膜解聚，从而接触部位的细胞膜发生融汇。

（3）电融合：可使供体细胞与受体卵母细胞的质膜有效融合，还可以激活卵母细胞。

5．重构胚的激活

（1）化学激活：通常用于已经通过其他方式发生融合的重构胚的激活，因此于后激活。常用于化学激活的试剂如下。

1）乙醇：把需激活的重组卵放入含7％ 乙醇的培养液中，在37 ℃、CO₂培养箱中处理5分钟或室温下处理7分钟，洗净后进行培养。

2）lonomycin（离子霉素）：使用浓度为5 μmol／L，处理时间为4-5分钟，此法可快速升高细胞质内的Ca2浓度。

3）钙离子载体A23187：使用浓度5 μmol／L，处理时间为5分钟。

4）6-DMAP（二甲氨基嘌呤）：使用浓度1.9～2 mmol／L，处理时间为3～5小时或更长。6-DMAP可以缓慢升高或维持细胞质内的Ca浓度。

5）Staurosporine：使用浓度为2 μmol／L，处理时间为15～30分钟。

（2）电激活：瞬时高压电流激活时，造成细胞膜暂时形成小孔或通透性增大，细胞内外的离子和小分子物质就可以通过这些小孔进行交换，结果产生了显著的跨膜Ca内流，从而激活了卵母细胞。