家兔胚胎冷冻技术

家兔胚胎移植往往会用到胚胎冷冻的技术，比如冷冻的桑椹胚胎在复苏后移植到受体输卵管中。

胚胎冷冻技术易于操作，能在卫生清洁的条件下保存生物材料的遗传信息完整性，包括细胞的线粒体基因组，使生物材料生物活性超越生命极限。

兔的妊娠期为1个月，通过胚胎移植就能很快获得幼崽。但是冷冻技术需要供体母兔获取大量胚胎，有一定的难度。

胚胎冷冻技术包括慢速冷冻和玻璃化冷冻。慢速冷冻的原理是基于放慢冷冻速度将使水分有足够的时间从细胞内释放，从而避免带来的致死性的胞内冰晶化。

冻存的速率由细胞的大小和透水性决定，大多数哺乳动物细胞在甘油或二甲亚砜冷冻保护剂中的冷冻速度约为1 ℃／min。

玻璃化冷冻的原理是基于冷冻保护剂起抗冻的作用，能降低冷冻的温度、增加冷冻样品的黏性。

玻璃化胚胎的胞质变成非晶质冰（玻璃化），与冰晶化过程由液体变为固体不同，非晶质冰是“固-液体”状态，这一状态在很小的温度范围内可相互转变。

器材：

①注射器

②外科手术器械

③CO₂培养箱

④体视显微镜

试剂：

①材料：家兔

②促卵泡激素（FSH）

③人绒毛膜促性腺激素（hCG）

④B2培养液

⑤胚胎暂存液（Hepes-DPBS＋20％ FBS）

⑥OPS-1冷冻液（Hepes-DPBS＋16％ FBS＋10％乙二醇＋10％ DMSO）

⑦OPS-II冷冻液（Hepes-DPBS＋0.6 mol／L蔗糖＋8％ FBS＋10％ 乙二醇＋20％ DMSO）

⑧冷冻保护溶液I（暂存液：OPS-I液＝1：1）

家兔胚胎冷冻的基本过程可分为如下几步：

一、胚胎收集

1.选用性成熟的新西兰雌性白兔（6～18月龄）作胚胎供体。

2.供体兔经超数排卵处理，处理方法是连续3天，每天两次肌内注射0.3 mg，0.4 mg，0.5 mg促卵泡激素（FSH）。

3.处理完FSH 12小时后，超数排卵处理的母兔与公兔合笼交配，并肌内注射200U的人绒毛膜促性腺激素（hCG）。

4.供体兔注射hCC与交配后18小时，用外科手术方法剪取出母兔的输卵管，在实验室中用5 ml的液从输卵管的壶腹部向喇叭口将胚胎冲出。

5.在体视显微镜下检查冲卵液，捡取出胚胎，放置在B2培养液内并在CO₂培养箱中培养。收集到的卵子在体视显微镜下检查其卵子第二极体的排出情况，与胚胎原核的显示，从而初步确定卵子是否受精。

二、胚胎的体外培养

1.挑选出质量好的胚胎放置于B2＋2.5％ FBS培养液中培养，并检查胚胎发育的状况。一般情况下，在注射hCG后20～22小时受精卵会分裂成2-细胞。

30～34小时将分裂成4～8-细胞期，40-46小时将发育到8-16-细胞期，3天将发育到桑椹胚和早期囊胚，培养4天的胚胎会发育到膨胀的囊胚，并开始孵化。

三、胚胎的玻璃化快速冷冻

1.将发育到8-细胞以上的胚胎（包括桑椹胚与囊胚）用于进行胚胎的冷冻保存和复苏。

2.拉细开口型细管（OPS）方法冷冻胚胎的程序是，配制如下溶液：

胚胎暂存液（Hepes-DPBS＋20％ FBS）．OPS-1冷冻液（Hepes-DPBS＋16％ FBS＋10％ 乙二醇＋10％ DMSO）。

OPS-II冷冻液（Hepes-DPBS＋0.6 mol／L蔗糖＋8％ FBS＋10％ 乙二醇＋20％ DMSO）。

冷冻保护溶液I（暂存液：OPS-I液＝1：1）。冷冻保护溶液II（暂存液：OPS-1l液＝3：1），所有溶液预热到38.5 ℃待用。

3. 3-5枚胚胎在暂存液中平衡5分钟后，移入OPS-1液中平衡2分钟，然后在3个OPS-II液的液滴中清洗胚胎（每个液滴洗涤20秒）。

4.将OPS管稍微热后拉制成只有一半直径的微管，将处理好的兔胚胎按照下面的顺序装入OPS管：-4 mm的一段OPS-II液→一段空气→一段含胚胎的OPS-II液→一段空气→～4 mm的一段OPS-II液。

用小塑料塞子塞住OPS管口以及用聚乙烯醇进行黏合。OPS管装完胚胎后，立即浸入液氮中保存。

四、玻璃化胚胎的复苏

2.平衡1分钟后，将胚胎移入冷冻保护溶液I中平衡5分钟。

3.复苏的细胞可转入B2胚胎培养液中培养，也可立即进行胚胎移植