大鼠体细胞核移植技术

克隆大鼠相比于小鼠、猪和牛等有成熟克隆体系的哺乳动物来说，大鼠克隆难度更高。大鼠胚胎体外培养体系不成熟是导致大鼠克隆胚胎发育率低的原因之一。

自然受精的大鼠胚胎，在现有的培养体系里经常会出现2-细胞阻滞的问题，从而导致囊胚率很低。大鼠MII期卵母细胞极容易发生自发激活是另外一个导致大鼠克隆胚胎发育率低的原因。

蛋白酶抑制剂MG132作为应用最为广泛的抑制大鼠卵母细胞自发激活的物质，能够有效提高大鼠克隆效率。

器材：

①显微操作平台：

由包括倒置显微镜（Leica，DMIRB，German）

液压显微操作臂（NARISHIGW，07003，Japan）

油压和气压注射控制器（Eppendorf，Cell-Tram，German）

Pizeo（PRIME TECH PMM，Japan）以及水平防震台组成

②注射器

③无菌手术器械

④离心机

⑤CO₂培养箱

试剂：

①材料：大鼠

②大鼠胚胎培养液MRIECM

③胚胎操作液M2

④蛋白酶体抑制剂MG132

⑤透明质酸酶（hyaluronidase）

⑥内丁酯I（butyrolactone I）

⑦氯化锶（SrCl2）

⑧秋水仙碱（demecolcine）

⑨石蜡

大鼠胚胎干细胞核移植的基本过程可分为如下几步：

（一）核移植相关溶液的准备

大鼠胚胎干细胞核移植所使用的相关药品及溶液包括：大鼠胚胎培养液MRIECM，胚胎操作液M2，蛋白酶体抑制剂MG132，透明质酸酶（hyaluronidase），内丁酯I（butyrolactone I）．氯化锶（SrCl2），秋水仙碱（demecolcine）等。

（二）供体细胞的准备

2.将培养液更换为新鲜的并含有0.05 μg／ml的微管形成抑制剂秋水仙碱作用3小时。

3.吸取处于悬浮状态的大鼠胚胎干细胞并消化3分钟，使用大鼠胚胎干细胞培养液制成单细胞悬液。

4.50％ ～80％ 的大鼠胚胎干细胞处于细胞分裂中期（MII期），置于冰上备用。

（三）大鼠卵母细胞的获取

2.将含有卵团的输卵管壶腹部剪下，放入预热并添加有5μmol／L MG132的M2体外操作液中。

3.快速划破输卵管壶腹部，使卵团游离出来。

4.将卵团迅速转入含有5 μmol／L MG132和0.1 mg／ml透明质酸酶（hyaluronidase）中2～3分钟。

5.结合口吸管的反复吹吸，以去除包裹在颗粒细胞-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs）外层的颗粒细胞。

6.将卵母细胞重新转移至5μmol／LMG132的M2体外操作液中，清洗2～3遍；

7.放入预热的含有5 μmol／LMG132的大鼠胚胎培养液mR1ECM-1C微滴中备用。

（四）核移植操作

1.用含有5 μmol／LMG132的M2操作液加入到自制操作皿“Chamber＂中，以液体石蜡覆盖。

2.用固定针吹吸卵细胞，找到卵母细胞内的遗传物质，并在其处于卵母细胞“3点”位置的时候，利用固定针固定卵母细胞。

3.将平口针在Piezo的作用下，在透明带上打出一个“小洞”。

4.吸取处于MII期的大鼠胚胎干细胞核物质，并将其直接注射进入胞质内，然后将注射针退出卵胞质，同时去除卵母细胞的遗传物质。

5.操作后的胚胎移回到mR1ECM-1C培养液微滴中，培养30分钟。

（五）重构胚胎的激活与培养

1.采用含有150 μmol／L butyrolactone1的mR1ECM-1C作为大鼠重构胚胎的激活液，激活时间为2小时。

2.采用氯化锶对卵母细胞进行孤雌激活，采用含有10 mmol／L氯化锶的mRIECM-1C作为激活液，激活时间为30分钟。需添加5 mg／ml细胞松弛素B（eytochalasin B．CB）处理6小时，以抑制第二极体排出，形成二倍体孤雌胚胎。

3.重构胚胎和孤雌胚胎激活完成后，移入大鼠mR1ECM-1C培养液进行培养，于此后24小时，72小时更换新鲜的培养液2次。

4.于重构完成后的24小时，72小时，96小时，108小时分别统计2-细胞，4-细胞，桑椹胚，囊胚的发育率。

（六）胚胎移植

1.使用浓度为0.05 g／ml的水合氯醛溶液对假孕大鼠进行麻醉，腹腔注射水合氯醛（每只1.5～2.0 ml）。10分钟后大鼠处于完全麻醉状态。

2.用75％ 乙醇消毒小鼠背部，剃毛后在背部体侧剪口，找到输卵管／子宫，用钟表镊轻轻夹住卵巢的脂肪垫，并将输卵管／子宫拉出。

3.在体视镜下把胚胎装入到口吸管中，口吸管按照三段法装管：先吸入一小段KSOM培养液，然后再吸入一个小气泡，再去吸取胚胎，吸完胚胎后再吸入一小个气泡和一小段KSOM培养液。将待移植的大鼠囊胚注入3.5天假孕鼠子宫角中。

4.移植后将子宫／输卵管小心放回大鼠腹腔中，并进行手术缝合。移植后的假孕鼠需放置在37 ℃热台上恢复，大约30分钟后大鼠自然苏醒。