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小鼠尾部皮肤的表皮毛囊全标本(whole mount)的标记保留细胞(LRCs)检测

相关实验:小鼠皮肤组织学分析实验

最新修订时间:

材料与仪器

器材:1 ml 注射器、尖头镊、染色缸、载玻片、盖玻片、显微镜

试剂:

① 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)(用 PBS 配成 10 mg/ml 的储液)


② 5 mmol/L 的 EDTA 溶液


③ 4% 多聚甲醛

④ 叠氮化钠

⑤ 蛋白酶 K

⑥ PBS 缓冲液

⑦ 盐酸

⑧ 曲通

⑨ 脱脂奶粉

⑩ 吐温

⑪ 甘油

步骤

小鼠尾部皮肤的表皮毛囊全标本(whole mount)的标记保留细胞(LRCs)检测的基本过程可分为如下几步:

A. 在小鼠 10 天日龄时,按 50 mg/kg 注射 BrdU,每 12 小时注射 1 次,共 4 次。

B. 在 60~70 天后,对小鼠处以安乐死,将尾部皮肤撕下,剪成约 0.5 cm x 0.5 cm 的小块。

C. 5 mmol/L 的 EDTA 溶液,37 ℃ 处理 2.5 小时。

D. 在解剖镜下用尖头镊将表皮带着毛囊与真皮层分开。

E. 4% 多聚甲醛,室温固定 2 小时。

F. 保存在含 0.2% 叠氮化钠的 PBS 中,4 ℃ 可保存约 8 周。

G. 做 BrdU 染色的当天,将表皮毛囊全标本取出,用 PBS 漂洗。

H. 蛋白酶 K 处理 20 μg/ml 的 PK,37 ℃ 处理 20 分钟。

I. 用 PBS 漂洗。

J. 2N 盐酸处理,37 ℃,25 分钟。

K. 用 PBS 漂洗。

L. 放入封闭液(3% 脱脂奶粉,0.5% 曲通溶于 PBS),4 ℃ 过夜。

M. 加溶于封闭液的抗 BrdU 的一抗,4 ℃ 过夜。

N. 用含 0.2% 吐温的 PBS 洗超过 4 次,每次 1 小时。每次洗的时候轻轻摇动。

O. 加溶于封闭液的二抗,4 ℃ 过夜。

P. 用含 0.2% 吐温的 PBS 洗超过 8 次,每次 0.5 小时。每次洗的时候轻轻摇动。

Q. 50% 甘油封片,镜检。结果示例如图 8-11-4 所示。

注意事项

1. 该实验是用来检测干细胞的数量和位置的。原理:干细胞在正常状态下处于静止状态,不常分裂增殖,所以会在打入 BrdU 后很久还保留有 BrdU,而其他细胞由于不停分裂增殖,会较快将打入的 BrdU 稀释至检测不到。

2. 由于尾部皮肤的表皮毛囊全标本是整体做实验,不会像切片会有每张片子在方向位置上不同导致的误差,所以用全标本来检测 LRCs 比较容易体现真实情况。

3. 最好做几次预实验确定取材时间点,一般在注射 BrdU 后 60~70 天。

来源:丁香实验

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