材料与仪器
器材：1 ml 注射器、尖头镊、染色缸、载玻片、盖玻片、显微镜
试剂：
① 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）（用 PBS 配成 10 mg/ml 的储液）
② 5 mmol/L 的 EDTA 溶液
③ 4％ 多聚甲醛
④ 叠氮化钠
⑤ 蛋白酶 K
⑥ PBS 缓冲液
⑦ 盐酸
⑧ 曲通
⑨ 脱脂奶粉
⑩ 吐温
⑪ 甘油
步骤
小鼠尾部皮肤的表皮毛囊全标本（whole mount）的标记保留细胞（LRCs）检测的基本过程可分为如下几步：
A. 在小鼠 10 天日龄时，按 50 mg/kg 注射 BrdU，每 12 小时注射 1 次，共 4 次。
B. 在 60～70 天后，对小鼠处以安乐死，将尾部皮肤撕下，剪成约 0.5 cm x 0.5 cm 的小块。
C. 5 mmol/L 的 EDTA 溶液，37 ℃ 处理 2.5 小时。
D. 在解剖镜下用尖头镊将表皮带着毛囊与真皮层分开。
E. 4％ 多聚甲醛，室温固定 2 小时。
F. 保存在含 0.2％ 叠氮化钠的 PBS 中，4 ℃ 可保存约 8 周。
G. 做 BrdU 染色的当天，将表皮毛囊全标本取出，用 PBS 漂洗。
H. 蛋白酶 K 处理 20 μg/ml 的 PK，37 ℃ 处理 20 分钟。
I. 用 PBS 漂洗。
J. 2N 盐酸处理，37 ℃，25 分钟。
K. 用 PBS 漂洗。
L. 放入封闭液（3％ 脱脂奶粉，0.5％ 曲通溶于 PBS），4 ℃ 过夜。
M. 加溶于封闭液的抗 BrdU 的一抗，4 ℃ 过夜。
N. 用含 0.2％ 吐温的 PBS 洗超过 4 次，每次 1 小时。每次洗的时候轻轻摇动。
O. 加溶于封闭液的二抗，4 ℃ 过夜。
P. 用含 0.2％ 吐温的 PBS 洗超过 8 次，每次 0.5 小时。每次洗的时候轻轻摇动。
Q. 50％ 甘油封片，镜检。结果示例如图 8-11-4 所示。
注意事项
1. 该实验是用来检测干细胞的数量和位置的。原理：干细胞在正常状态下处于静止状态，不常分裂增殖，所以会在打入 BrdU 后很久还保留有 BrdU，而其他细胞由于不停分裂增殖，会较快将打入的 BrdU 稀释至检测不到。
2. 由于尾部皮肤的表皮毛囊全标本是整体做实验，不会像切片会有每张片子在方向位置上不同导致的误差，所以用全标本来检测 LRCs 比较容易体现真实情况。
3. 最好做几次预实验确定取材时间点，一般在注射 BrdU 后 60～70 天。
来源：丁香实验
