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大鼠胚胎移植

相关实验:大鼠胚胎与卵巢的移植

最新修订时间:

简介

胚胎移植俗称人工授胎或借腹怀胎,是指将雌性动物的早期胚胎,或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内,使之继续发育为新个体的技术。


本质上即生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程。利用胚胎移植技术可以充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。


卵巢移植即将某一雌性动物的卵巢整体切除并移植给另一去除卵巢的雌性动物卵巢部位。卵巢移植对于治疗卵巢癌等恶性疾病具有重要意义。

材料与仪器

器材:


①镊子
②磁性电动按摩器
③带有26~30号针头的1 ml注射器
④培养皿

⑤37 ℃,5% CO2培养箱


试剂:


①材料:大鼠
②含有HASE的HERs培养基
③75% 乙醇
④水合氯醛溶液
⑤红霉素软膏

步骤

胚胎移植的基本过程可分为如下几步:


一、胚胎移植假孕受体的制作


(一)雄性大鼠的输精管结扎


1. 雄性大鼠麻醉后,腹部向上,腹部 75% 乙醇消毒,在睾丸附近腹中线处开一小口。


2. 用镊子夹住脂肪垫将睾丸拉出;用精细镊子在睾丸附近找出输精管,用另一把镊子撕掉周围的结缔组织。


3. 将一把镊子在输精管内侧自然张开裸露输精管,另一把镊子将输精管镊住固定,用烧红的镊子分别在两侧烧灼将输精管切断;烧灼以后输精管的两断口均形成密封口,切下的一段丢弃。


4. 将睾丸、附睾和输精管等放回腹腔内;用镊子夹住脂肪垫拉出另一侧睾丸,进行同样的结扎手术;将睾丸、附睾和输精管等放回腹腔内;缝合肌肉、皮肤;将大鼠放在保温台上保温,等待苏醒。


(二)假孕受体的制作


1. 挑选 8 周龄的健康性成熟雌性大鼠,挑发情。


2. 将发情雌性大鼠与同品系输精管结扎雄性大鼠进行交配;次日见栓记为 0.5dpc。假孕见栓 0.5dpe 可用于大鼠发育各阶段胚胎的胚胎移植,假孕见栓 3.5dpc 仅用于大鼠囊胚移植。


(三)电动按摩器诱导大鼠假孕


1. 挑选 8 周龄的健康性成熟雌性大鼠,挑发情;磁性电动按摩器音频为 10~20kHz,在按摩器顶端用胶布固定一长约 8~10 cm,直径 2~3 mm 的钝头玻棒。用改装的电动按摩器,于上午 9~10 时,刺激发情期动物的阴道。将电动玻棒头插入阴道 2~2.5 cm 处,相当于子宫颈外口处,打开电源刺激阴道 60~180 秒。


二、胚胎移植


(一)各时期大鼠胚胎的获取


1.对雌性大鼠进行超数排卵处理;见栓记为 0.5dpc,取 2-细胞期胚胎通常在交配后 28~32 小时;取 4-细胞期胚胎通常在交配后 36 - 48 小时。


2. 取 8-细胞期胚胎,在交配后 56 小时左右;囊胚在 3.5 天;取交配后相应时间的大鼠,用颈椎脱臼方法处死,仰卧固定于实验台上,用乙醇喷雾小鼠腹部,进行表面消毒。


3. 打开腹腔,连同子宫一起采取输卵管,再剪下输卵管准备灌流。一般用带有 26~30 号针头的 1 ml 注射器,吸取含有 HASE 的 HERs 培养基 300 μl 进行输卵管灌流,灌流后带有胚胎的培养基滴入培养皿中。挑选发育时期准确且发育状态良好的胚胎,移入事先准备的新鲜的 200 μl 的 M2 培养液液滴中,每个液滴中移入 20 枚左右的胚胎。在 M2 中清洗后的胚胎移入大鼠胚胎培养液 mRIECM-2C 并放入 37 ℃,5% CO2 培养箱中培养。


(二)胚胎的输卵管内移植


1.腹腔注射浓度为 0.05 g/ml 的水合氯醛溶液(每只 1.5~2.0 ml)对假孕大鼠进行全身麻醉,大约 10 分钟后大鼠处于完全麻醉状态。


2. 卧位固定于超净手术台上,剃毛后在背部体侧剪口,找到输卵管/子宫并将其拉出。在毛细移液管(外径 200~250 μm)内间隔 2 - 3 mm 交替吸入培养液和空气泡,然后再吸入 10 个左右的胚胎。


3. 取一个精细钟表镊和一把鼻科剪刀,在输卵管伞部与膨大部之间剪一小口,在切口部插入吸入胚胎的毛细移液管,一直插到输卵管的膨大部。


4. 用精细镊子固定住插入毛细移液管的输卵管开口部。将毛细管内的胚胎和空气泡吹入输卵管膨大部;轻缓地取出毛细移液管。移植后将子宫、输卵管小心放回大鼠腹腔中,并进行手术缝合,伤口涂红霉素软膏抗感染。


5. 术后假孕鼠需放置在 37 ℃ 热台上恢复,大约 30 分钟后大鼠自然苏醒。


(三)子宫内移植


1.腹腔注射浓度为 0.05 g/ml 的水合氯醛溶液(每只 1.5~2.0 ml)对假孕大鼠进行全身麻醉,大约 10 分钟后大鼠处于完全麻醉状态。


2. 卧位固定于超净手术台上,剃毛后在背部体侧剪口,找到输卵管/子宫并将其拉出。在毛细移液管(外径 200~250 μm)内间隔 2~3 mm 交替吸入培养液和空气泡,然后再吸入 10 个左右的胚胎。


3. 利用口吸管将待移植的大鼠囊胚注入 3.5 天假孕鼠子宫角中,轻缓地取出口吸管。


4. 移植后将子宫、输卵管小心放回大鼠腹腔中,并进行手术缝合,伤口涂红霉素软膏抗感染。


5. 术后假孕鼠需放置在 37 ℃ 热台上恢复,大约 30 分钟后大鼠自然苏醒。

来源:丁香实验

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