人蜕膜基质细胞的分离及纯化

子宫内膜蜕膜化是胚胎着床及成功妊娠的关键步骤。蜕膜组织的细胞成分相当复杂，其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75％，是母胎界面的主要组成细胞。

这些细胞起源于间质的成纤维细胞，形态较大，呈多边形，高水平分泌催乳素（prolactin，PRL）等多种激素，参与蜕膜的营养供应和内分泌微环境的形成。

胞质内富含波形蛋白，不含细胞角蛋白（cytokeratin 7，CK7），可用作蜕膜基质细胞的鉴定。

人蜕膜基质细胞的分离及纯化的基本原理是来源于间质的DSC可通过调节蜕膜免疫细胞的功能参与维持母胎免疫耐受，从流产组织中取出较厚实的蜕膜，通过酶消化后研磨过滤，并进行密度梯度离心。

根据细胞的密度可以吸取20％ ～40％ 密度层初步获得DSC，通过短期培养去除悬浮细胞进一步纯化DSC。

然后根据细胞群的形态、表型及功能特点，利用免疫组织化学方法对细胞进行鉴定；通过体外传代培养的方法获取大量、纯度较高的DSC，为更深入的研究细胞在母胎耐受中的作用提供基础。

试剂：

PBS溶液、D-Hanks溶液、RBC裂解液

RPMI 1640细胞培养液、DMEM／F12培养液

胎牛血清、胰蛋白酶、胶原酶IV型、DNA酶I型

Percoll 原液、抗生素

仪器：

眼科剪，镊子，不同规格筛网（100目）

各类培养皿，注射器柄，不同规格塑料离心管

1.5 ml EP管，吸管，台式冷冻离心机

磁极及磁珠分选柱，CO₂孵育箱，水浴摇床，流式细胞仪。

人蜕膜基质细胞的分离及纯化的基本步骤可分为以下几步：

1．挑取厚实的蜕膜组织，在预冷的D-Hanks液中反复冲洗，吹打清除血污后将干净组织置于无菌培养皿中，用眼科剪剪碎成1 mm3组织块。

2．加入0.1％ 胶原酶IV（或与50 μg／ml DNase I合并消化组织）于37 ℃水浴振荡消化1小时后，用含10％ FBS的DMEM／F12细胞培养液终止消化。

经100目筛网研磨过滤，获得的细胞悬液300 g离心10分钟，弃去上清。

3．将细胞团重悬于3 ml D-Hanks液中，小心铺于不连续Percoll密度梯度界面（60％、40％、20％ 三种梯度），1000 g离心20分钟。

4．吸取20％ ～40％ 梯度层之间的细胞（p＝1.031～1.056），即为初步分离的DSC，洗涤后重悬于含10％ FBS的DMEM／F12细胞培养液中。

5．所获细胞置37 ℃、5 ％CO₂培养箱中培养30分钟后换液，去除悬浮细胞，贴壁细胞即为纯化的DSC。

6．将细胞置于37 ℃、5％ CO₂培养箱中继续培养5～7天后，当培养瓶中的细胞铺满瓶壁，融合度达80％ 时可传代。

先弃去培养液，D-Hanks液轻洗2次，加入消化酶液2 ml消化细胞2分钟后，倒置显微镜下观察90％ 细胞变圆，加入2 ml FD完全培养液终止消化。

并用吸管反复吹打制成单细胞悬液，分别接种于新的培养瓶中，于37 ℃、5％ CO₂、饱和湿度的培养箱继续培养传代。

1．根据各自实验室的实际情况，对蜕膜组织进行消化亦可采用0.25％ 胰蛋白酶和0.02％ 乙二胺四乙酸（EDTA）按1：1比例配制的消化酶液，于37 ℃恒温水浴锅中震荡消化20分钟。