用 Bio-Rad 385 Gradient F ormer 灌制线性梯度凝胶实验

丙烯酰胺浓度逐渐增加(凝胶孔径线性减小）的线性梯度凝胶有着更多的优点。首先，线性梯度凝胶可以分离更大分子量范围的蛋白质。其次，它还能将分子量非常相近的蛋白质分离开。最常用于梯度胶的丙烯酰胺浓度是4 % 〜20 % ，但具体采用哪一范围的丙烯酰胺浓度还是取决于被分离的蛋白质的大小（见表2.2和表2.4)。

异丁醇 丙烯酰胺
制胶板 梯度混合 搅拌 子

（1）计算每一凝胶灌制模具所需溶液体积。

a•用间隔片的厚度乘以要灌制的凝胶的长、宽及胶的数目后，再除以2。

b.装好凝胶灌制模具后，加水至所需位置，测量用去的水的体积，并除以2。注意在灌制凝胶前灌胶装置必须是干燥的。

(2)从凝胶灌制模具顶部或底部灌入凝胶溶液。

①从顶部灌入：

a.装好凝胶三明治夹板，如图2.6所示。

b•剪短连接管，使流出管的夹子和泵，以及泵与三明治夹板之间的距离最短。连接管与梯度混合器和蠕动泵。用胶条将管的末端固定在玻璃板中间。

c•将搅拌子放进混合器。

d.根据想要达到的样品分离效果，配制合适的、不含聚合引发剂的丙烯酰胺轻液（浓度低的凝胶溶液）和重液（浓度高的凝胶溶液）（见表2.2和表2.4)。如有必要，适当排气。

e.往轻液中加人聚合引发剂，迅速混合均匀后倒入贮液池。这时的腔间阀一定要处于关闭状态。

f.将聚合引发剂加人重液，混合后倒人混合器。

g.开启磁力搅拌器，调整速度，使漩涡底部与轻液中的漩涡底部在同一高度。

h.打开腔间阀和流出管的夹子，启动蠕动泵。设定的速度要能使所有梯度溶液在10min内泵进凝胶灌制模具（如10ml/mm)。

i.当所有溶液都泵入三明治夹板中后，关闭蠕动泵。

J•从凝胶灌制模具上移开连接管，放置于废液缸中。

k.在凝胶层上铺上水饱和的正丁醇。

l.在每个灌制模具中都加入水，把蠕动泵开启到最大速度冲洗这个系统。

②从底部灌入：

a.如果使用底部有一个垫圈的凝胶灌制腔，用管将泵和这个垫圈相连。

b•遵循上面的步骤，直至完成步骤h。但不同的是，这里要将轻液倒进混合池，而重液倒进贮液池。

c.当所有丙烯酰胺溶液都进入凝胶灌制腔时，关掉蠕动泵，小心别让气泡进入灌制腔。

d•完成上面的步骤j〜1。