未解析碎片离子的检索实验

蛋白样品
质谱仪

数据库同样可以检索一个单个肽段及其碎片离子的质量。肽段质量同它的碎片离子质量一起提供了非常具有鉴别力的判断标准，可用于在序列数据库中检索，包括由表达序列标签翻译的序列数据库（图 5.3) 。这一手段已被广泛用于凝胶分离蛋白质酶水斛后产生的肽段鉴定。肽段通常用上文所述的一些方法，在质谱仪气相中被诱导产生碎片离子，例如 PSD-MALDI-MS, 或三级四极质谱及离子阱中的 CID。在这些仪器中，肽段离子断裂的方式具有序列特异性，主要沿肽骨架的肽键断裂，见图 5.4 所示。

如果肽离子的正电荷保留在碎片离子的 N 末端，此离子被称为 b 系列离子，用下行数字代表这一碎片离子中的氨基酸残基数目，从 N 末端起为1 。因此， b 离子代表 C 末端缺失， N 未端完整的碎片离子。如果电荷保留在 C 末端，离子被称为 y 系列离子：与 b 系列离子一样有下标数字，但从 C 末端数起）。因此 y 离子代表N末端缺失， C 末端完整的碎片离子。 CID 谱图是由几千种独立的裂解过程产生数据的混合图，即 b 系列和 y 系列离子的混合图。谱图中也存在一些其他离子：氨基酘侧链 (Gln, Lys, Arg) 中性丢失氨、产生少 17个质量数的离子；筑基酸侧链 (Ser, Thr, Asp, Glu) 中性丢失 H₂O 产生少 18个质量单位的离子：以及从 b 系列离子中性丢失 co 产生少 28个质量范围的离子，即 a 系列离子：另外，如果一个肽段离子发生多次裂解，就会产生中间碎片，包括酰基离子 (acyl, 由至少 2个氨基酸残基组成，见图 5.4b) 和亚氨离子（见图 5.4c 和表 5.2), 亚氨离子代表单个氨基酸的质量，因此提供了肽段的部分氨基酸组成。井不是所有的肽键在 CID 条件下都具有相同的断裂倾向，在同一张 MS/MS 谱图中产生的碎片离子的强度也有显著差异。

最常发生的断裂是在脯氨酰 (prolyl) 键上，通常产生 CID 诸图中的最强离子峰，另外，不稳定的脯氨酰 (prolyl) 键断裂还导致产生了敕常见的中间碎片酰基离子 (acyl), 并从脯氨酸残基延伸到 C 末端令如上所述，肽段裂解可由 PSD- MALDI- MS 产生，也可用三级四极或离子阱质谱的CID诱导产牛。这二种方法中 由 PSD-MALDl-MS 导致的裂解最不易控制，在 PSD-MALDI-MS 中仅有的可变参数是激光通量和基质。另外，在 MALDI-MS 中只产生单电荷离子，电喷雾离子化产生的双电荷和一电荷离子相比，需要更多的能量使其断裂。因此 PSD-MALDI-MS 的成功率很低，在很多情况下，同一样品的 PSD 谱图质量比 ESI仪器的 CID 分析谱图差很多。碎片离子谱图包含有重复的信息，例如重叠的 b 和 y 系列离子以及同一肽段的多个中间离子。这种重复使碎片离子谱成为极丰富的序列特异信息来源，但也使序列的解析更加复杂，因为通常不能直接判断某一离子归属于哪一种离子系列。