ESI 三级四极质谱仪操作

在 ESI源中，含有被分析样品（多肽／蛋白质）的溶液流经一个细细的进样针，针头上加高电压(+ 1000-5000V) 用来产生正离子，见图 5.2a。高电压导致样品液流分散为呈喷雾状的带高电荷的微小液滴，质谱仪入口端的有孔平板上加有+ 100--1000V的低电压，引导离子通过入口 （orifice）, 这一入口是离子源和质谱仪的连接处，离子源处于大气压环境，质谱仪处于真空系统。 当液滴从针尖通往入口时，在定向惰性气体流（有时加热）的作用下溶剂蒸发，使液滴缩小, 液滴电荷密度增加，最终导致液滴爆裂，离子从液相中杆放出来进入气相。离子通过入口后，在一个只加有射频场 (radio frequency, RF) 的四极杆控制下进入质量分析器，可以是四极杆、四极杆－飞行时间、或离于阱质量分析器, ESI 产生的多肽离子的特征是带多电荷，电荷数与肽分子中可电离的集团数目有关。 如果用 ESI-MS 正离子模式分析胰酶酶切肽段，大多数肽段都会带至少两个电荷、一个在 N 末端的 NH₂ 基团上, 另一个在胰酶酶切位点，肽段C未端碱性氨基酸的侧链上，

三级四极质谱仪由三套四极杆组成（图S.2b)- 四极杆滤质器既可以传送混合物中所有的离子（以射频 RF-only 方式工作），又可以充当质量过滤器，只允许特定质荷比的离子通过。四极杆由 4个平行的圆棒构成，相向的一对圆棒上施加电极相反的直流和交流电压。当离子漂移通过四极杆圆棒的中间区域时，改变四极杆上施加的电压，使具有特定 m/z质荷比的离子才能通过，所有其他质荷比的离子改变了线性飞行烙径，从分析器中消失，如果四极杆上施加的电压连续变化（扫描），由通道－电子倍增器记录通过滤质器的离子数目, 并与特定的离子m/z质荷比建立函数关系，就得到一张质谱图。四级质量分析器通常可分析的质量范围是2500 - 4000u, 因为记录的是m/z，而不是多肽质量本身，而且 ESI 通常产生带多电荷的肽离子，所以使用 ESI 源的四极质量分析器能用来分析远远超出其质量分析范围的蛋白质。在三级四极质谱中，第一级 Q1 和第三级 Q3 四极杆是质量过滤器，第二级四极杆Q2 仅施加射频电压，充片产生碎片离子的碰撞室，从 Q1传送来的肽离子在碰撞室内经重的惰性气体如Ar和 N2的碰撞诱导，产生正离子，这一过程种为碰撞诱导解离(collision-induced dissociation, CID) 。

二级四极质谱仪有 5 种工作模式

(1) MS 模式 这种模式用于分析未解离的离子质量。扫描 QI, Q2 中未引入裂解气体， Q3 为射频电场模式 也可以使 Q1处于射频模式，扫描 Q3 电场实现质量测定。

(2) MS/MS模式（也称为产物离子扫描法， product ion scan) 在一个给定的时间点， Q1 设定为仅传输某一选定质荷比的离子，此离子进入 Q2 后，经碰撞诱导解离，产生的碎片离子通过扫描 Q3 进行检测。这样得到与 Q1 选择的初始肽段离子相关的碎片离子质谱图。Q1 选择母离子，在 Q2 内进行 CID, Q3 分析碎片离子, 这一分析过程不断循环，用以选择分析不同质量的肽段离子。实际上，某些仪器如 TSQ 7000 (Finnigan, MAT, San Jose, CA) 可以设定程序自动在 MS 和 MS/MS 模式间切换，将 MS 检测到的离子进行 CID 分析，并记录碎片离子的质谱图，整个过程不需要用户介入。 这过程称为数据依赖的 CID (data-dependent CID) 产物离子扣描法可用来测定肽段的氨基酸序列。

(3) 中性丢失扫描模式 (neutral loss scan mode) 此模式中 Q1 和 Q3 的电压同步打描，但保待一个特定m/z值的电压差 (offset)。 Q2 是碰撞室， Q1 和 Q3 的电压差值与 Q2 内碰撞消除的一个特定中性分子的质量一致。因此，在离子混合物中，只有碰撞裂解后能丢失这一特定基团的离子才会被 Q3 传输到检测器，例如，在磷酸肽与非磷酸肽混合物中，通过对 49 m/z的 H3PO4 的中性丢失扫描，可以检测出磷酸肽的双电荷峰。在离子被传送到检测器时，已经知道 Q1 和 Q3 上各自施加的特定电压，所以可以确定发生中性丢失的肽段质量。

(4) 前体离子（母离子）扫描 (precursor/parent ion scanning) 此模式中扫描 Q1电压， Q3 设置为只传输某一特定质荷比离子， Q2 为碰撞室。与 “中性丢失扫描相似，前体离子扫描检测离子混合物巾在 Q2 碰撞中丢失特定基团的离子。与中件丢失扣描个同的是 前体离子扫描模式直接检测断裂的基团（报告离子，reporter ion) 。检测器检测到报告离子时，已知 Q1 的电压，所以可以确定产生这一特定碎片的前体离子的质量。因此前体离子扫描模式被用来检测肽混合物中某些含有特定结构特征的肽段。

(5) 源内 CID (in-source CID) 裂解发生在ESI源内由大气压气体碰撞产生的高压区内，可以选择碰撞条件使肽链骨架断裂 或使一些相对不稳定的基团如磷酸基闭选择性断裂。所带电荷数大于1的肽段离子更容易断裂，因为在这些离子上分配的动能远大于仅仅将这些离子聚焦到 Q1 分析器所需的动能。 这一方法提供了在三级四衱质谱仪中实现 MS/MS/MS 分析的机会及在单级四极质谱仪中实现 MS/MS 分析的机会以上任一种扫描类型都适用于源内 ClD 产生的离子。为了鉴定蛋白及对肽段从头测序，仪器通常以 MS/MS 模式运行。对选择离子施加的碰撞能量可以通过改变碰撞气体的压力而变化，如果时间允许，可以对裂解过程实现很好的控制。在数据依赖操作模式中，质谱仪由程序控制，对 MS 模式检测到的超过一预先设定的离子流阙值的离子自动进行碰撞诱导解离，碰撞能量匀速变化, 以期在不同碰撞能量中得到的谱图中全少得到一张最佳裂解碎片谱。但是，当样品量极少，样品溶液通过微量或钠喷 (nano-spray) 装置引入源内，且样品未脱盐时，得所谱图的化学背景和杂质峰占据主导地位 。因此，为在这样的混合物中找肽段离子，质谱仪可以前体离子扫描模式运行，将 Q3 分析器设定力 86m/z，即亮氨酸 Leu 和异亮氨败 Ile 的亚氨离子 (immonium ion) 质量，通常在许多肽段序列中都存在这两种氨基酸 。