氧化反应
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原理
GAPDH,D-磷酸甘油醛;NADP+ 氧化还原酶(磷酸化)。
D-3-磷酸甘油醛 + NAD+⇌ 1,3-磷酸甘油醛+ NADH + H+
酶的实验既可以在正反应方向也可以在偶联后的逆反应方向进行。正反应中,必须加入不稳定且很昂贵的 DL-3-磷酸甘油酸。
材料与仪器
3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液
三乙醇胺 · HCl DL-磷酸甘油酸 NAD+ 砷酸二氢钾
分光光度计
三乙醇胺 · HCl DL-磷酸甘油酸 NAD+ 砷酸二氢钾
分光光度计
步骤
实验所需「试剂」具体见「其他」
0.98 ml 实验混合物
0.02 ml 酶溶液
在 25℃ 时,于 340 nm 处吸收值降低。NADPH 的吸收系数 ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
常见问题
试剂:
0.1 mol/L 三乙醇胺 · HCl/NaOH pH 7.6(三乙醇胺 · HCl,Mr=185.7;溶解 18.6 g 于 800 ml H2O 中,用 1 mol/L NaOH 调节至 pH 7.6,补充到 1 L)
0.3 mol/L DL-磷酸甘油酸(Mr=170.1;不稳定,水状溶液 50 mg/ml)
0.1 mol/L NAD+(游离酸,Mr=663.4;663 mg 溶于 10 ml 水中)
0.1 mol/L 砷酸二氢钾(Mr=180.0;180 mg 溶于 10 ml 水中)
来源:丁香实验