噬斑扩增实验

痘苗病毒可以在 HeLa S3 细胞中大量繁殖，其他的细胞系可用于噬斑纯化和扩增。

重悬重组噬斑 贴壁生长良好的细胞 HeLa S3 细胞
完全 MEM-10 和 MEM-2.5 培养基 筛选试剂（麦考酚酸 黄嘌呤／次黄嘌呤） 5-溴脱氧尿苷（BrdU） 干冰／乙醇
杯状超声仪 5 ml锥形离心管 Sorvall 离心机（或相当的离心机） 150 cm2 组织培养瓶

实验试剂准备详见「其他」。

1. 将重悬的重组噬斑置于含有冰水的杯状超声仪上，以最大的功率超声 20～30 s。

2. 每个噬斑取 250μl （1/2） 感染 12 孔组织培养板中汇片生长的单层细胞。培养 1～2 h，每隔 15 min 轻轻摇动一次。

3. 用 1 ml 含有合适筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基覆盖细胞。

3 .1 对于 XGPRT 筛选，含有 1/400 体积的 10 mg/ml MPA、1/40 体积的 10 mg/ml 黄嘌呤、1/670 体积的 10 mg/ml 次黄嘌呤。

3.2 对于 TK 筛选，含有 1/200 体积 5 mg/ml BrdU。培养 2 天或者直到细胞病变（细胞变圆）明显。

4. 用细胞刮刀轻轻刮下细胞，转移到微量离心管中，最大转速，离心 30 s，弃培养基。

5. 将细胞用 0.5 ml MEM-2.5 培养基重悬。反复冻融法裂解细胞悬液：用干冰/乙醇将细胞冻结，再用 37℃ 水浴及涡旋使细胞解冻。如此进行 3 次。

6. 将重悬的细胞悬液置于冰上，在杯状超声仪上以最大功率超声 20～30 s。

7. 用 0.75 ml 含有筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基（见步骤 2 和 3） 稀释 0. 25 ml 来自步骤 6 的裂解液，感染 25 cm2 组织培养瓶中汇片生长的单层细胞，培养 30 min。

8. 用 4 ml 含有适当筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基（见步骤 3） 覆盖细胞。培养 2 天或者直到细胞病变（细胞变圆）明显。

9. 用细胞刮刀轻轻刮下细胞，转移到 15 ml 锥形离心管中，5～10℃，1800 g 离心 5 min，弃培养基。细胞用 0.5 ml MEM-2.5 培养基重悬。按照步骤 5 和 6 的方法反复冻融法裂解细胞悬液和超声。

10. 用血细胞计数器对旋转培养瓶培养的 HeLa S3 细胞进行细胞计数。

11. 将 5 ×10⁷ 个细胞在离心机中室温 1800 g 离心 5 min，弃上清。

12. 将细胞悬浮于 25 ml 完全 MEM-10 培养基中，放入 150 cm2 组织培养瓶中，培养过夜（第二天进行感染）。

13. 吸出培养基，加入 0.25 ml 的细胞裂解液（步骤 9）和 1.75 ml 完全 MEM-2.5 培养基。培养 1 h，每隔 15～30 min 轻轻摇动一次。

14. 加入 25 ml 完全 MEM-2.5 培养基（此步骤不需要筛选），培养 3 天。

15. 使细胞与培养瓶分离（如果需要可以借助摇晃或细胞刮刀），用吸管将细胞悬液转移到离心管中，于 5～10℃，1800 g 离心 5 min，弃培养基。

16. 细胞用 2 ml MEM-2.5 培养基重悬。按照步骤 5 的方法反复冻融裂解细胞悬液。

17. 测定病毒储液的滴度，再将其存放于 -70℃。

如果用 XGPRT 筛选，贴壁培养的细胞先用含有麦考酚酸、黄嘌呤、次黄嘌呤的完全 MEM-2.5 培养基预培养 12～24 h （见「重组细胞筛选实验」步骤 4.1）。感染也必须在这些试剂存在的条件下进行。

完全 MEM-10 和 MEM-2.5 培养基

筛选试剂（XGPRT 筛选；抽滤除菌，-20℃ 保存）：

10 mg/ml （400 ×）麦考酚酸（MPA； Calb10chem），溶于 0.1 mol/L NaOH；

10 mg/ml （40 ×）黄嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH；

10 mg/ml （670 ×）次黄嘌呤， 溶于 0.1 mol/L NaOH

5 mg/ml 5-溴脱氧尿苷（BrdU），溶于水（TK筛选；抽滤除菌，-20℃保存）

干冰/乙醇