基本方案

本实验首先是制备植物新鲜组织匀浆、过滤,分离出完整的叶绿体,然后通过蔗糖密度梯度离心,把叶绿体与其他亚细胞结构分离开来。完整叶绿体经蛋白酶K酶解后,再通过酚-氯仿抽提获得高纯度的叶绿体DNA。

以下所有操作除特别指明外均在4℃进行。将搅拌器和离心管预冷,使用冷藏的缓冲液并在冰筒中操作。

1.准备750ml缓冲液A,使用前往500ml缓冲液中加入BSA。

2.收集25～30g健康的嫩叶,在提取之前可将植株置于黑暗中培养24～28h以降低淀粉含量。如果植物材料已被感染或弄脏了,可先用次氯酸钠(5%)处理5min,然后用自来水漂洗2～3次。

3.除去叶片中间的叶脉,称重。此法适用于约20g的植物材料。将叶片切成1cm2大小的碎片,将10g碎片置于含有BSA的约200～250ml的缓冲液A中(只有在匀浆时使用的缓冲液A中加入BSA),在搅拌器中高速匀浆,每次约10s,重复2～3次。

4.用50μm的尼龙筛过滤提取物。在含BSA的200～250ml缓冲液A中对所剩的碎片再次匀浆和过滤。不能通过50μm尼龙筛的匀浆物可集中起来再匀浆,每次10s,重复两次,再过滤。

5.用20μm的尼龙筛对提取物进行第二次过滤。

6.提取液3000r/min离心10min。

7.用软笔刷轻轻将沉淀重悬于30ml不含BSA的缓冲液A中,再离心。绿色沉淀的底部可见白点,那是淀粉,应尽量避免重悬起淀粉。根据淀粉的含量,可以重复这一冲洗步骤4～6次。

8.在冲洗的同时,可以制备蔗糖梯度液。分级梯度液底层为3.5ml60%的蔗糖溶液,中间为3.5ml40%的蔗糖溶液,顶层为3.0ml20%的蔗糖溶液,不同梯度层要轻轻混匀,得到扩散中间相。可以用一个长的巴氏吸管小心地在层间上下搅动几次(巴氏吸管的末端开口应封上)。

9.小心将沉淀物重悬于总体积2～6ml的缓冲液A中,将悬液分别加入有分级梯度液的2～6个小管中。梯度平衡后置于水平转头上26000r/min4℃离心1h。

10.将位于45%～20%蔗糖溶液中间层的叶绿体带用宽口移液管转至50ml的离心管中。

11.缓慢加入3倍体积的缓冲液A(防止叶绿体破裂)。开始时逐滴加入并轻轻搅匀(全部加完约要10～15min)。5000r/min离心5min,收集叶绿体。

12.小心将沉淀重悬于3ml缓冲液A中,加入1/5体积的缓冲液B(用前加入蛋白酶K),并于50℃保温15min,使叶绿体裂解。

13.在室温下抽提叶绿体DNA2次。加入1倍体积的酚(以TE饱和),颠倒小管数次混匀。室温下5000r/min离心10min,使两相分离。收集上层溶液,再用1倍体积的酚-氯仿(1∶1,V/V)抽提一次。

14.将DNA溶液(水相)转至一个30ml的离心管中,加入1/10体积3mol/L乙酸钠和2.5倍体积的99%乙醇,-20℃沉淀DNA过夜。

15.在4℃下,10000r/min离心15min,收集DNA。

16.弃上清液,真空抽干沉淀(不要过度抽干沉淀)。

17.将DNA溶于400μlTE缓冲液,这可能需要几个小时,将小管放于冰上操作。

18.把DNA转至一Eppendorf管中,加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2体积的99%乙醇,-20沉淀DNA过夜。

19.在微型离心机上,4℃,13000r/min离心15min,收集DNA。

20.弃上清液,用20%乙醇清洗沉淀,再离心,重复清洗步骤。离心,真空抽干沉淀。

21.将沉淀溶于50～150μlTE缓冲液中,在-20℃或4℃保存。DNA产量一般可达10～100μg。

1.加入每管蔗糖梯度液的叶绿体量会影响DNA的纯度,一般来说,25ml蔗糖梯度液中加入10～20g新鲜叶片中所得到的叶绿体。本实验中所用的梯度液为10ml,为避免使本程序中使用的量小一些的梯度液过载,可以将叶绿体分装在2～6个管中,梯度液的总体积应根据不同植物材料摸索而定。

2.人们通常用CsCl梯度溶液进一步纯化叶绿体DNA,而且CsCl纯化的叶绿体DNA可以用于克隆,但CsCl梯度离心耗时更多。本实验程序也得到高纯度的叶绿体DNA,可以检验其纯度能否用于克隆

具体试剂描述：

1.缓冲液A(提取缓冲液):0.3mol/L山梨醇 ,50mmol/L Tris-HCl,20mmol/L EDTA,0.1% BSA(用前加)。

2.缓冲液B(裂解缓冲液):0.5%SDS,50mmol/L Tris-HCl,0.4mmol/L EDTA,0.1%蛋白酶K(W/V),pH8.0。蛋白酶K用前加,由于缓冲液B在室温下会出现沉淀,因此,使用前可先将缓冲液加热。

3.TE缓冲液:10mmol/L Tris,5mmol/L Na₂EDTA,pH7.5。

4.蔗糖梯度:60%、45%和30%的蔗糖,溶于缓冲液A。

5.尼龙筛(50μm和20μm),酚(TE缓冲液饱和,pH8.0),99%和70%的乙醇,3mol/L乙酸钠。