基于 AFLP 的转录表达谱分析

Total RNA
链霉亲和素包被的磁珠 洗涤缓冲液 EDTA 第一链缓冲液 第二链缓冲液 DTT 4 dNTP 的混合物 SuperScript II RNase H STEX Tris· Cl RL缓冲液 ATP PCR 缓冲液 T4 多核苷酸激酶缓冲液 加样染料 硅烷 黏合硅烷溶液 变性聚丙烯酰胺凝胶 TBE 分子质量标准物 乙酸
微量离心管 磁座 PE-9600 热循环仪 PCR 板 测序凝胶系统 磷屏

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 在一个无 RNase 的微量离心管里混合 200 ug 总RNA、600 ng 5'-生物素化的 oligo-dT₂₅ （5-生物素-dT₂₅）和 300 ul 2× 结合缓冲液。用水调整体积到 600 ul。70°C 加热 5 min， 随后室温放置 15～20 min。

2. 用 0.5 ml 的 1× 结合缓冲液洗涤 150 ul 的链霉亲和素包被的磁珠（见下面步骤 4 关于技术和微量离心管的使用）。磁珠重悬于 50 ul 同样的缓冲液中。

3. 把这些洗过的磁珠，加入含 RNA 的混合物里（步骤 1）室温下轻轻搅动，温育 30 min。

4. 把微量离心管放在磁座上 30 s，然后吸掉尽可能多的上清，不要搅动磁珠或让它们干掉。把管子从磁座上拿下来，加入 0.5 ml 洗涤缓冲液，彻底混勻。重复 2 次以上，最后一次洗后吸掉上清。

5. 把磁珠重悬在 20 ul 12 mmol/L EDTA 中，70°C 加热 5 min 洗脱 poly （A）⁺ RNA。按步骤 4 用磁座收集磁珠，尽可能快地转移上清到一个新的无 RNase 的微量离心管里，不要吸取任何磁珠。重复一次，总共得到约 40 poly （A）⁺ RNA。 如果长期保存，加入 0.1 倍体积的 2 mol/L， pH 5.5 的乙酸钠，混匀，加入 3 倍体积的 100％ 乙醇，可以无限期地保存于 -20°C。回收时，最高速离心 5 min， 弃掉上清，在旋转蒸发仪上晾干，用双蒸水或缓冲液重悬到原来的体积。

6. 用 5 ul poly （A）⁺ RNA 溶液连同分子质量参照物一起进行琼脂糖凝胶电泳，检查分离的 poly （A）⁺ RNA 的产量（平均约 2 ug）和质量。电泳应该在大约 10 kb 以下出现很弱的拖尾（低分子质量）夹杂极少量的 rRNA。

7. 混合以下反应液，合成第一链 cDNA：

10 ul poly （A）⁺ RNA（约 0.5 ug）

0.5 ul 700 ng/ul 5-生物素-dT₂₅（逆转录引物）

2 ul H₂O

4 ul 5× 第一链缓冲液

2 ul 0.1 mol/L DTT

1 ul 10 mmol/L dNTP

0.5 ul 200 U/ul 的 SuperSript II （最后加）

42°C 温育 2 h。

8. 混合以下反应物，进行第二链合成：

20 ul 第一链 cDNA 合成混合物（来自步骤7）

16 ul 5× 第二链缓冲液

1.5 ul 10 mmol/L dNTP

3 ul 0.1 mol/L DTT

7.5 U E.coli DNA 连接酶

25 U E.coli DNA 聚合酶 I

0.8 U RNaseH

加水到 80 ul。

12°C 温育 1 h，然后 22°C 再温育 1 h。用琼脂糖凝胶检查 cDNA 的质量和产量。

9. 用 100 ml 的 2×STEX （技术方面见步骤 4）洗涤 25× 链霉亲和素包被的磁珠。重悬在 80 ul 的 2×STEX 中。

10. 把磁珠悬液加入 cDNA 混合物里，室温轻轻搅动，温育 30 min。

11. 用磁座收集磁珠（步骤4），用 100 ul 的 1×STEX 洗一次，转移到一个新的微量离心管里。用 1×STEX 再洗两次，最后把磁珠重悬在 50 ul 的 H₂O 或 10 mmol/L的 Tris·Cl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA。

12. 混合下面的反应物：

20 ul cDNA 样本（一般 100～200 ng）

10 U TaqI 限制性内切核酸酶

8 ul 5×RL缓冲液

用水调整体积到 40 ul。

65°C 保温 1 h。

13. 加入如下成分：

10 U MseI 限制性内切核酸酶

2 ul 5× RL 缓冲液

用水调整体积到 50 ul。

37°C 温育 1 h。

14. 混合 8.5 （1500 pmol） 的长链和 8 （1500 pmol）短链用于制备Taql接头。用水调整体积到30 ul。

15. 混合 8.5 ug（1500 pmol）的长链和 8 ug （1500 pmol）短链用于制备 TaqI 接头。用水调整体积到 30 ul。

16. 用 TagI 和 MseI 消化的 cDNA 片段（步骤 12、13）中加入下述试剂：

1 ul 各种接头（各 50 pmol； 步骤 14、15）

1 ul 10 mmol/L ATP

2 ul 5× RL 缓冲液

10 ul H₂O

37°C 温育 1 h。加入 1 U T4 DNA 连接酶，37°C温育 2 h。

17. 用 Tris-HCl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA 10 倍稀释一小份（2～5 ul）模板混合物（步骤16)。准备如下扩增反应：

5.0 ul 1：10稀释的模板混合物

1.5 ul 各 8 pmol/ul 的 AFLP＋0 （非选择性）引物

2.0 ul 5 mmol/L dNTP （每种 dNTP 的终浓度为 0.2 mmol/L）

5 ul 10× PCR缓冲液

1 U Ampli Taq DNA 聚合酶

加水到 50 ul。

18. 在 PE-9600 热循环仪上运行下面的温度循环进行扩增：

20 轮：

30 s 94°C（变性）

60 s 65°C（引物复性）

60 s 72°C （引物延伸）。

19. 取 10 ml 反应混合物和分子质量参照物一起电泳，检查预扩增的情况。 应该看到位于 50～500 bp 之间的，呈拖尾状的弥散产物。

20. 按 1：500 稀释 2 ul 非选择性的预扩增cDNA片段（也就是＋0/＋0）到Tris· Cl （pH 8. 0）/0.1 mmol/L EDTA。

21. 在一个适合于 PE-9600 的热循环仪的 PCR 板上准备选择性预扩增反应（＋1/＋1）：

21.1 分装 5 ul 1：500 的非选择性预扩增 cDNA 片段到 PCR 板上的前两列（1和2）的每一个孔中。

21.2 分装 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 T 叫 TaqⅠ+A 到 A1 至 D1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+C 到 E1 至 H1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ＋G 到 A2 至 D2 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+T 到 E2 至 H2 的孔中。

21.3 分装 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋A 到 A1、A2、E1 和 E2 中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋C 到 B1、B2、F1 和 F2 中，1.65 ul 的 8 pmol/ul 的引 物 MseI＋G 到 C1、C2、D1 和 D2 中，1.4 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseI＋T 到 D1、D2、H1 和 H2 中。

21.4 混合 32 ul 5 mmol/L dNTP， 80 ul 的 10× PCR 缓冲液 ，16 U 的 AmpliTaq-Gold 聚合酶，用水调整体积到 672 ul，配制成 dNTP/聚合酶混合液。

21.5 分装 42 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前两列的每个孔中。

22. 运行下面的降落： 温度循环程序进行 AFLP 扩增：

13 轮：

30 s 94°C（变性）

30 s 65°C- 0.7°C/轮（引物复性）

60 s 72 0C （引物延伸）

20 轮：

30 s 94°C（变性）

30 s 56°C（引物复性）

60 s 72°C（引物延伸）

23. 准备下面的磷酸化反应混合物：

2.0 ul 10 uCi/ul （约 2000 Ci/mmol） ［³³P-γ］ ATP

1.0 ul 10× T4 多核苷酸激酶缓冲液

4 U T4多核苷酸激酶

加水到 8 ul。

24. 混合 2.0 ul 8 pmol/ul 的选择性引物（＋2）和 8 ul 的磷酸化反应混合物（步骤 23），磷酸化 16 pmol的选择性 TaqI＋2 引物（20 个 AFLP 反应所需的量；也就是，对一个给定的 TagI＋2 引物，整套 256 种引物组合种所有 16＋2/＋2 的反应所需的量），产出的标记引物浓度为 12.6 pmol/ul， 终体积 10 ul。37°C 温育 60 min，随后 70°C 加热 10 min 失活激酶。

25. 把 2 ul 各个预扩增产物（＋1/＋1；22 步）用 Tris·Cl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA 稀释 500 倍。在一个适合于 PE-9600 的热循环仪的 PCR 板上准备选择性扩增反应（＋2/＋2）：

25.1 分装 2 ul 1：500 的预扩增混合液 TaqI＋A/MseI＋C 到 PCR 板上的前两列。

25.2 分装 0.5 ul 标记的引物：TaqI＋AA 到 A1 至 D1 的孔中，0.5 ul 标记的引物 TaqI＋AC 到 E1 至 H1 的孔中，0.5 ul 标记的引物 TaqI＋AG 到 A2 至 D2 的孔中，0.5 ul 标记的引物 TaqI＋AT 到 E2 至 H2 的孔中。

25.3 分装 0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CA 到 A1、A2、E1 和 E2 孔中，0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CC 到 B1、B2、F1 和 F2 孔中，0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CG 到 C1、C2、D1 和 D2 中，0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CT 到 D1、D2、H1 和 H2 中。

25.4 混合 12.8 ul 5 mmol/L dNTP， 32 ul 的 10×PCR 缓冲液，6.4 U 的 AmpliTaq- Gold 聚合酶，用水调整体积到 270.4 ul， 配制成 dNTP/聚合酶混合液。

25.5 分装 16.9 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前两列的每个孔中。

26. 按照步骤 22 中的「降落」 PCR 程序扩增产物。

27. AFLP 反应中加入等体积（20 ul）的上样缓冲液。90°C 加热 3 min 变性 AFLP 反应产物，然后快速置于冰上冷却。

28. 测序凝胶系统的后玻璃板用 2 ml 排斥型硅烷处理，前玻璃板用 10 ml 的黏合型硅烷处理。准备 4.5％ 的变性聚丙烯酰胺凝胶（约 100 ml）。

29. 用 1×TBE 作电泳缓冲液，上样前预电泳 0.5 h， 使用合适的电泳条件使凝胶加热到约 55°C （如对 BioRd 系统固定 110 W）。用温度计监测凝胶的温度。

30. 每孔上样 3 ul（48 道的凝胶）或 1.5 ul（96 道的凝胶）的样品，约 55°C 电泳分析。 如果需要的话，加上一个分子质量参照物（如 SequalMark 10-base 序列阶梯）。

31. 电泳完成后，卸下凝胶。因为硅胶的处理，凝胶会黏附在前板上。凝胶浸泡在 10％ 的乙酸里 30 min 以固定凝胶。用水彻底淋洗凝胶，在通风橱里室温干燥 10～21 h， 或使用较高温度 （如使用温度浴）干燥较短时间直到凝胶不再发黏。

32. 放射自显影或用磷屏显示凝胶分离的 cDNA 片段。

1. 所有接触RNA的溶液和材料必须是无RNase的，RNA的操作必须使用正确的操作技术。

2. 供应商和品牌一般不是十分重要，然而当遇到问题的时候，建议至少使用推荐商标的逆转录酶（SuperScript II）和 Taq 聚合酶（AmpliTaq 和 AmpliTaq-Gold）。

3. 当准备 AFLP 扩增的时候，建议尽可能使用混合好的试剂混合液。使用试剂混合液有助于配制反应，也非常有助于结果的可信度和重复性。在实际操作中，混合液的配制因实验而定，即确定哪一个成分在一系列反应中是不变的：模板还是引物的组合（例如，一个样品和许多不同的引物组合，许多样品和一个引物组合）。

4. 甲酰胺是有害的，在通风橱里进行这一步操作。

5. 放射性物质需要特殊的操作。

1. 材料

Total RNA

2. 试剂

5' 生物素化的 dT₂₅（5-生物素-dT₂₅）

1× 和 2× 结合缓冲液 H₂O： Milli-Q 纯化的水（也就是经过五级Milli-QPhis系统处理的去离子水；Milipore）或双蒸水

链霉亲和素包被的磁珠（Dynal）

洗涤缓冲液

2 mmol/L EDTA，pH 7.5

5× 第一链缓冲液

5× 第二链缓冲液

0.1 mol/L DTT

5 和 10 mmol/L（每个）4 dNTP 的混合物（Amersham Pharmacia Biotech)

SuperScript II （Life Technologies）

E.coli DNA 连接酶（Life Technologies）

E.coli DNA 聚合酶 I （Pharmacia Biotech）

RNase H （Pharmacia Biotech）

1× 和 2×STEX

10 mmol/L Tris· Cl，pH 8. 0/0.1 mmol/L EDTA

TagI 限制性内切核酸酶（New England Biolabs）

5×RL缓冲液

MseI 限制性内切核酸酶（New England Biolabs）

50 pmol/ul 带 TagI 黏性末端的连接子

750 pmol/ul 带 Msd 黏性末端的连接子

10 mmol/L ATP （Amersham Pharmacia Biotech）

T4 DNA 连接酶（Amersham Pharmacia Biotech）

8 pmol/ul AFLP＋0 （非选择性）引物（见寡核苷酸和双链连接子的说明）：TaqI＋0 和 MwI＋0 引物

10×PCR 缓冲液

Ampli Taq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer）

10 uCi/ul （约 2000 Ci/mmol）［³³P-γ］ATP （Amersham Pharmacia Biotech）

10× T4 多核苷酸激酶缓冲液

T4 多核昔酸激酶（Amersham Pharmacia Biotech）

8 pmol/ul AFLP+1 和 +2 （选择性）引物（见寡核苷酸和双链连接子的说明）： Ta9I+1 和 +2 和 MseI＋1 和＋2 引物

Ampli Taq-Gold 聚合酶

加样染料

硅烷（Amersham Pharmacia Biotech）

黏合硅烷溶液，新配制：在 10 ml 的乙醇里混合 30 ul 的黏合硅烷（Amersham Pharmacia Biotech） 和 30 ul 冰醋酸

4.5％ 的变性聚丙烯酰胺凝胶

1× TBE 分子质量标准物（如 SequalMark 10-base ladder； Reserch Genetics；可选）

10％ （V/V）乙酸

3. 耗材

微量离心管，无 RNase

磁座（MPC； Dynal）

PE-9600 热循环仪（Perkin-Elmer）和 PCR 板

测序凝胶系统（如 BioRad 38× 50× 0.04 cm SequiGen 测序凝胶系统）

磷屏（Fujix BAS 2000，Molecular Dynamics STORM 824）