免疫印迹法 （以检测流行性出血热病毒结构蛋白和 NP 核蛋白为例说明）

免疫印迹法 是将电泳与免疫酶染色结合起来的一种方法。它先经电泳 (SDS--PAGE)将病毒结构蛋白进行分离，通过转印将被分离的各区带原位转移到硝酸纤维素膜 (nitrocellulose membrane, NC 膜）上， NC 膜当成包被抗原的固相载体，病毒的结构蛋白能与特异性的第一抗体发生反应，借助酶标记第二抗体及底物，在相应部位显现出来，以证明病毒结构蛋白的存在。所以操作分为电泳、转印和酶免疫测定三个阶段。

1) 样品制备：病毒感染 Vero E6 细胞后的上清培养液，经 4℃ 5000 r/min 离心 30 min, 离心后的上清移至超速离心管（每管 35 ml 左右），加 300 g/L 蔗糖-TNE 垫层， 25000 r/min 离心 2 h, 弃上清，用少量 TNE 悬起沉淀即为初步纯化病毒。

2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE): 采用不连续系统，将 25µl 样品加等量样品缓冲液混合，煮沸 2 min 待冷却后上样。电泳条件为稳流 10-20 mA,9-12 h 或 50V恒压电泳过夜 (14-16 h) 。电泳结束后取下凝胶。

部分凝胶进行常规考马斯亮蓝染色：浸入1g/L 考马斯亮蓝溶液（水：甲醇：冰醋酸 =5:5 : 1) 中1 h,取出凝胶用脱色液 (5%甲醇，10% 冰醋酸水溶液）脱色，换液数次后，用无考马斯亮蓝的 5% 甲醇、10% 冰醋酸水溶液在脱色摇床上继续脱色至透明，照相记录。

3) 蛋白条带的电转移：上述剩余的大部分凝胶置于 NC 膜上，电转移时在双层夹板中的层次顺序为：正极夹板海绵滤纸NC 膜凝胶滤纸海绵夹板负极。电流方向从负极至正极，条件为电流 0.5-0.7 A, 电压 100~120V, 时间 4~6 h 。

4) 免疫酶染色：转移完毕后，将 NC 膜浸入封闭缓冲液，在脱色摇床上摇动 2~6 h, 于封闭液中直接加人特异性抗血清或恢复期病人血清（或特异性单克隆抗体），置 37℃ 2 h, 用 2g/L Tween 20 PBS 洗涤液洗 4 次，加相应的辣根过氧化物酶标记抗体 (IgG),置 37℃l h, 同样洗涤 4次，加酶染底物溶液显色数分钟，用自来水冲洗，终止反应。

(5) 结果：经初步纯化的病毒标本，经上述电泳，考马斯亮蓝直接染色后或经转移，抗体及酶染色反应后，在相应部位可见三个明显流行性出血热病毒结构蛋白条带，从上到下分别代表病毒结构蛋白 G1 (72~68 kD) 、 G2( 55~52 kD) 糖蛋白和 NP 核蛋白 (50~48 kD), 以 NP 显色最为明显。

免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，方法简便、标本可长期保存、结果便于比较。

其他试剂：

l)TNE缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl,pH7.4-7.6 0.15 mol/L NaCl,5 mmol/L EDTA。

2)分离胶：2 mol/L pH8.9 Tris-HCl 10 ml,(单）丙烯酰胺/（双）丙烯酰胺(50:0.8/100 ml)12.5 ml,100 g/L SDS 0.5 ml,10 mol/L尿素12.5 ml,TEMED 50µl,过硫酸铵(30mg/ml)1.1ml,双蒸水13.4ml,总量约50ml。

3)浓缩胶：0.5 mol/L pH6.7 Tris-HCl1ml,(单）丙烯酰胺/（双）丙烯酰胺(50:1.5/100ml)1 ml,100 g/L SDS 0.1ml,10mol/L尿素5ml,TEMED 10µ1,过硫酸按(30 mg/ml)0.3 ml,双蒸水2.7 ml,总量约10 ml。

4)电泳缓冲液：Tris 12g,甘氨酸57.6 g,100 g/L SDS 20 ml,加蒸馏水到2,000 ml。

5)样品缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl(pH6.7),20 g/L SDS,5% 2-琉基乙醇，10%甘油，0.2g/L溴酚蓝。

6)转移缓冲液：Tris 7.88g,甘氨酸28.8g,甲醇400 ml,加蒸馏水到2000 ml。

7)封闭缓冲液：0.02 mol/L pH7.4 PBS,2g/L Tween20,20 g/L牛血清蛋白。

8)酶染稀释缓冲液：0.02 mol/L pH7.4 PBS,0.5-1.0g/L Tween20,10%牛血清。

9)洗涤液：0.02 mol/L pH7.4 PBS,2g/L Tween20。

10)酶染底物溶液：3,3'-二氨基联苯胺（盐酸盐）(DAB)5 mg,0.0 2mol/L pH7.4 PBS 10 ml,H₂O₂原液50μl