Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶分析实验

1 mg ml 钙调蛋白（- 70℃ 小量储存） 有 CaM 激酶活性的酶样品 10 mmol L 合成肽底物溶液
[γ-32P] ATP 溶液 5 × CaM 激酶反应缓冲液
30℃ 水浴

1. 对 1.5 ml 微量离心管做双管标记，每个反应按以下比例加入各反应组分：

5 μl 5×CaM 激酶反应缓冲液

5 μl 10 mmol/L 合成肽底物溶液

5 [γ-³²P] ATP 溶液（ATP 终浓度为 5 mmol/L， 放射活性为 5 μCi/μl）

5 μl 1 mg/ml 钙调蛋白或 5 μl 水

0～30 μl 水

盖好离心管，混匀，放入 30℃ 水浴温育 10 min。

2. 每 30 s 一管依次加入 1～25 μl 酶样品开始反应。加入酶量的容积取决于样品中酶活性的大小。在预试验中所得的最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。

3. 30℃ 水浴，10 min。

4. 温浴 10 min 后迅速吸取 30 μl 管中溶液滴在准备好的 P⁸¹ 膜上。

1. 实验中每个反应的容积为 50 μl， 但它可为 25～100μl，只需根据比例对各反应组分进行适当调整。每个反应应分别设立无钙调蛋白的对照，以便能评估磷酸转移的反应本底，从而精确检测 Ca2+/钙调蛋白依赖性的磷酸转移反应。

2. 由于多肽不能被 TCA 有效沉淀，而进行 PAGE 分析需要一些特殊技术。因此，只有吸附在 P⁸¹ 磷酸纤维膜上才能用于 CaM 激酶介导的磷酸转移测定。