利用双杂交系统相互作用阱／筛选特定蛋白的肽适配体
最新修订时间：
材料与仪器
PCR 引物 聚乙二醇 甘油存储液 Tris·Cl X-gal 平板 完全极限（CM） 缺失成分培养基和平板
30℃ 和 42℃ 培养箱或水浴
步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 使用标准的亚克隆技术，将编码诱饵蛋白的 DNA 插入 PEG202 的多克隆位点构建诱馆质粒（pBait）。
2. 按照乙酸锂酵母转化法用 pBait 和 pSH18-34 （lacZ 报道载体）转化相互作用阱筛选酵母株（EGY48）。
3. 将转化株涂布到 Glu／CM-His、-Ura 平板上，放置于 30℃ 培养箱中。
4. 进行 lacZacZ 激活和亮氨酸需求平板检测以确保诱饵蛋白不会自己激活报道基因。
5. 用阻遏测试法确定诱饵蛋白的合成。
6. 将转化的 EGY48（步骤 3）接种到 20 ml Glu／CM-His、-Ura 液体培养基，于 30℃ 振荡过夜。
7. 测量 OD600 吸光值，在 250 ml Glu／CM-His、-Ura 培养基中稀释至 5×106 细胞／ml。 0.1 的 OD600 相当于大约 3×106 细胞／ml。这个数值应当在每个应用的酵母株得到确认。
8. 于 30℃ 振荡培养细胞至 OD600 为 0.6～0.8 （约 5～6 h）。
9. 将培养液分为 5 个 50 ml 圆锥形离心管中，室温下于 3000 g 离心 5 min。
10. 弃上清，将酵母沉淀重悬于 25 ml 无菌水中，重复离心。
11. 弃上清，将酵母沉淀重悬于 1 ml 100 mmol／L 乙酸锂中。移到一 1.5 ml 微量离心管中，室温下 20800 g 离心 15 s 沉淀酵母。
12. 吸去上清，重悬酵母于 350 ul 100 mmol／L 乙酸锂中（终体积约 500 ul）。
13. 将每个管中的溶液分为 10 个 50 ul，室温下 20 800 g 离心 15 s 沉下酵母。
14. 吸去上清，依次加入下列成分：
240 ul 50％（m／V）PEG 3350
36 ul 1 mol／L 乙酸锂
50 ul 2 mg／ml 单链载体 DNA （100 ug）
25 ul 40 ug／ml 肽适配体库 DNA （1 ug）。
在使用前，单链载体 DNA 需要加热到 95℃ 放置 5 min， 然后放冰上冷却。
15. 剧烈振荡转化混合物直至酵母沉淀完全重悬起来，然后于 30℃ 孵育 30 min。
16. 于 42℃ 热激 20 min。
17. 室温下 20 800 g 离心 15 s 沉下酵母。
18. 吸去上清，重悬酵母于 500 ul 无菌水中。
19. 将 48 个转化株分别涂布到单独的 15 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 平板上。
20. 两个剩下的转化株各取 400 ul 涂布到 15 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 平板上。
21. 用剩下的 100 ul 测定转化效率。用水进行一系列 10 倍的稀释，然后涂布到 10 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 平板上。
22. 于 30℃ 孵育 2～3 天（直至克隆的直径约为 1 mm）。
23. 将 50 个转化平板上的酵母（步骤 19、20）收集到的一个 50 ml 的离心管中。
24. 加入等体积的 2×甘油存储液到收集的酵母细胞中。分装为 1 ml 的小份并存储于 -70℃。
25. 检测冻存的小份酵母的平板效率。
26. 接种肽适配体库的 10 个库等价物到 2 ml Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp 液体培养 基中。于 30℃ 振荡培养 4 h。 一个库等价物等于含有肽适配体库的酵母转化株的总数，如步骤 21 所检测的。
27. 室温下于 3000 g 离心 4 min。
28. 吸去上清，重悬酵母于 1 ml 无菌水中。
29. 将酵母以 106 个酵母细胞／平板的密度涂布到 15 cm Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、-Leu 的平板上。
30. 于 30℃ 培养，每天观测平板生长情况。
31. 将克隆划线接种到 10 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 的主平板上。于 30℃ 培养 1～2 天。
32. 将主平板在下列指示平板上复制：
Glu／CM-His、-Ura、-Trp、-Leu
Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、－Leu
Glu／CM-His、-Ura、-Trp、X-gal
Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、X-gal
33. 鉴定出在 -Leu 平板上呈半乳糖生长依赖性并且在 X－gal 平板上呈半乳糖依赖的蓝色的克隆。
34. 提取所需的肽适配体表达质粒。
35. 以质粒为模板，对肽适配体的可变区进行测序。
36. 为了从 pBait 和 pSH18－34 中分离出适配体质粒，转化 E.coli 并用扩增硫氧还蛋白的引物通过 PCR 鉴定出正确的转化株。
常见问题
1. 材料
编码所感兴趣的诱饵蛋白的 DNA
质粒 DNA： PEG202， PSH18－34
酵母株：EGY48 ura3 trp1 his3 3LescA-operator-Leu2
2. 试剂
2 mg／ml 单链载体 DNA （钠盐 Ⅲ 型，源于鲑鱼睾丸，Sigma） 溶于 TE 缓冲液
40 ug／ml 肽适配体库 DNA （pJM－1 适体质粒）
硫氧还蛋白的 PCR 引物
完全极限（CM） 缺失成分培养基和平板，补加 2％ （m／V） 葡萄糖 （Glu） 或 2％ （m／V） 半乳糖和 1％ （m／V） 棉籽糖 （Gal／Raf）：
Glu／CM-His、-Ura （10 cm 板或液体培养基）
Glu／CM-His、-Ura、-Trp（10 cm 和 15 cm 板）
Glu／CM-His、-Ura、-Trp、-Leu （10 cm 板）
Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp （液体培养基）
Gal／Raf／CM-His、-Ura、－Trp、-Leu （10 和 15 cm 板）
100 mmol／L 和 1 mol／L 乙酸锂，pH 7.5，过滤除菌
50％ （m／V） 聚乙二醇，mol.wt.3350 （PEG 3350； Sigma）
2× 甘油存储液：65％ （V／V） 甘油／0.1 mol／L MgSO4／25 mmol／L Tri·Cl，PH7.4
10 cm X-gal 平板：
Glu／CM-His、-Ura、-Trp、X-gal
Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、X gal
3. 耗材
30℃ 和 42℃ 培养箱或水浴
来源：丁香实验
