原理
含有胸苷卤代物如溴脱氧尿苷(BrdU)的DNA比非取代的DNA对紫外线诱导的 交联更为敏感。本方案中的紫外交联效率是0.1%〜10%,而且在单一复合物中出现1 次以上交联事件的情况十分罕见。
材料与仪器
17 bp 的 M13 通用引物 1×和10×限制性内切核酸酶缓冲液 (分别含500μmol L和500 mmol L NaCl) 3000 Ci mmol [α32P] dCTP 50×dNTP BrdU 溶液 0.lmol L 二硫苏糖醇(DTT)
DEAE 膜(Schleicher &- Schuell NA45) 0.5 mL圆底 螺旋盖的小瓶(Nunc或相当产品) 水浴锅 紫外透射仪
步骤
1)将10μL含有高亲和性蛋白结合位点的目的序列的单链M13载体与等摩尔的17 bp M13通用引物混合。用1×限制性内切核酸酶缓冲液(50 mmol/L NaCl)将终体积调至100μL。90℃加热5min,在室温下冷却过夜。
2) 将下列反应物加入杂交混合物中:
50μL [α32P] dCTP (3000 Ci/mmol)
3.5μL 50× dNTP/BrdU 溶液
1.75μL 0.1 mol/L 二硫苏糖醇(DTT)
7.5μL 10×限制性内切核酸酶缓冲液(NaCl终浓度50 mmol/L)
7μL H2O
5μL Klenow 酶(25 U)
16℃温育 90 min。
3) 68℃加热 10 min 灭活 Klenow 酶。
4) 在合适条件下,用40U限制性内切核酸酶消化,产生20〜600 bp的DNA片段。
5) 加乙酸铵至0.3 mol/L,用2倍体积的100%乙醇沉淀DNA,重悬于TE缓冲液中。
6) 在含有0.5μg/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳。用DEAE膜分离所要的DNA片段。
7) 用闪烁计数器检测BrdU取代的DNA片段的特异活性,并用溴化乙锭点迹定量法估计DNA的浓度。
探针的完整性和功能可用迁移率变动DNA结合分析法进行检测。
8) 在1.5 mL圆底小瓶中建立下列结合反应:
105cpm均衡标记的探针、经缓冲的含有结合蛋白的提取液、10~20μg DNA 载体如 poly (dl-dC) • poly (dl-dC)。总体积调至50μL。用塑料薄膜封口,再加封Parafilm膜固定。
9) 将小瓶置于试管架上,用倒置的紫外透射灯(305nm,7000μW/cm2) 在正上方5 cm处照射60 min
10) 在各结合反应管中加入以下反应物:
1μL 0.5 mol/L CaCl2
4μg DNA 酶 I
1U微球菌核酸酶 37℃消化 30 min。
11) 加入等体积的2×SDS样品缓冲液到反应混合物中,100℃煮沸5min。
12) 在适当浓度的不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对样品进行电泳,包括14C 标记的蛋白质分子质量标记物。
13) 电泳结束后,切去凝胶前沿的染料。
14) 干胶,并且用增感屏放射自显影1〜3天,以观测交联的蛋白质。
常见问题
其他所需试剂:25 U大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,乙酸铵,100%乙醇,TE缓冲液,经缓冲的含有DNA结合蛋白的提取液,大分子载体 DNA,如 poly (dl-dC) • poly (dl-dC),0.5 mol/L CaCl2,DNA 酶 I (Worthington),1 U微球菌核酸酶(Worthington),2×SDS样品缓冲液,Fluor (Du Pont NEN Enhance 或相当物),14C标记的蛋白质分子质量标记物
来源:丁香实验