使用重组的果蝇因子进行染色质装配实验

重组的 NAP－1 纯化的果蝇核心组蛋白 重组的 ACF 质粒 DNA
HEG 缓冲液 KCl PvOH PEG 溶液 BSA 溶液 MgCl2 CaCl2 重组的拓扑异构酶 Ⅰ 工作溶液 缓冲液 R 微球菌核酸酶储液 EDTA RNase A 糖原终止缓冲液 酚 氯仿 异戊醇 乙醇
27℃ 和 30℃ 水浴

1. 实验前准备

1.1 材料

0.5～4.0 mg/ml 重组的 NAP－1

0.3～2. 0 mg/ml 纯化的果蝇核心组蛋白

0.002～0.2 mg/ml 重组的 ACF

1.2 试剂

HEG 缓冲液

300 mmol/L KCl（以 0.1～1 ml 分装，－20℃ 保存）

PvOH/PEG 溶液

2 mg/ml BSA 溶液（以 0.1～1 ml 分装，－20℃ 保存）

0.5 mol/L ATP（以 0.1～1 ml 分装，－20℃ 保存）

0.5 mol/L 磷酸肌酸

5 mg/ml 肌酸激酶

100 mmol/L MgCl₂（以 0.1～1 ml 分装，－20℃ 保存）

0.3～2.0 mg/ml 质粒 DNA，双 CsCl 纯化，溶于 TE 缓冲液中

10×拓扑异构酶 Ⅰ

重组的拓扑异构酶 Ⅰ 工作溶液

ACF 稀释缓冲液：含有 0.4 mg/ml 重组入胰岛素（Roche）的洗涤缓冲液 F

200 U/ml 微球菌核酸酶储液

缓冲液 R

10 mmol/L CaCl₂（以 0.1～1 ml 分装，－20℃保存）

0.5 mol/L EDTA

10 mg/ml RNase A

糖原终止缓冲液

2.5 mg/ml 蛋白酶 K

50：49：1（V/V/V）酚/氯仿/异戊醇，用 10 mmol/L Tris·Cl， pH 8.0 平衡

2.5 mol/L 乙酸铵

100％ 乙醇

1.3 耗材

硅烷化的 1.5 ml 聚丙烯管子（如 ISC BioExpress， Cat.＃ C－3302－1）

27℃ 和 30℃ 水浴

2. 解冻所有的缓冲液和蛋白质。

所有的缓冲液都必须平衡到室温（通过不断的吹吸）。蛋白质必须快速解冻（在室温水浴中，轻弹混匀或轻柔的涡旋混合，转移到冰上）并且使用完后应快速冷冻（在液氮中）。ACF、Nap－K 核心组蛋白及微球菌核酸酶（但不包括作为单独的多肽表达和纯化的拓扑异构酶Ⅰ 或 ISWI）可以承受多次的冷冻－解冻循环（大约 10 次）。小量的工作浓度的拓扑异构酶Ⅰ（含有 50％ 甘油）可以储存于 －20℃ 而不冻结大约 3 个月左右。

3. 在 1.5 ml 硅烷化的微量离心管中加入如下溶液制备 NAP－1 和核心组蛋白（NH）的主混合液：

172 HEG

7 ul 300 mmol/L KCl

84 ul PvOH/PEG 溶液

4.2 ul 2 mg/ml BSA

6.4 ul 2 mg/ml NAP－1

3.03 ul 0.7 mg/ml 核心组蛋白

轻轻地涡旋混勻 2～3 S。

4. 吸取 56.6 ul 步骤 2 中的 NH 混合液（室温）分别到 5 个硅烷化的 1.5 ml 微量离心管中。冰浴≥20 min 使组蛋白与 NAP－1 结合。

5. 制备 ATP 与镁离子的主混合液（AM）： 3 ul 0.5 mol/L ATP， 30 ul 0.5 mol/L 磷酸肌酸，16.5 ul 蒸馏水，25 ul 100 mmol/L MgCl₂。使用前加入 0.5 ul 5 mg/ml 肌酸激酶。

6. 准备 DNA 模板，将下列溶液混合：

7.64 ul 质粒 DNA（0.42 mg/ml）

2 ul 10×拓扑异构酶Ⅰ缓冲液

2.36 uI 重组的拓扑异构酶Ⅰ工作溶液

8 ul 蒸馏水

30℃ 温育 10 min 以使 DNA 松弛；放置于室温备用。

染色质抑制拓扑异构酶Ⅰ对 DNA 的松弛作用。因此，反应中的拓扑异构酶Ⅰ应比经 10 min 的 30℃ 温育后使超螺旋的质粒完全松弛所需的量超出 5～10 倍。纯化的系统在缺少拓扑异构酶时也 可以高效地在线性的超螺旋 DNA 上组装染色质。在后一种情况下，模板必须有高于 95％ 的超螺旋 DNA（通过两轮的 CsCl 分带获得）。

7. 用 ACF 稀释缓冲液制备 ACF 稀释液（2～10 U/ul）。置冰上。

1 U 的 ACF 等于 22 fmol 蛋白质。

8. 按如下所述进行 5 个装配反应：

8.1 步骤 3 中的 56.6 ul NH 中加入 1 ul ACF（2～10U）。

8.2 从冰上取下管子，平衡到室温。

8.3 加入 10.5 AM 主混合液（步骤 4），以及 2 ul DNA 模板（使用过量的拓扑异构酶Ⅰ变松弛或超螺旋的；步骤 5）。旋即轻轻涡旋混匀 2～3 S。

8.4 27℃ 装配 1.5～2.5 h。加了所有组分后轻轻地涡旋混匀反应液，短暂地离心一下并收集溶液至管底。加入 DNA 模板后 马上混匀反应液是十分重要的。

9. 在马上使用前，准备两个微球菌核酸酶在缓冲液 R 中的稀释液：1：500 和1：1500。

10. 每个反应中加入 17.5 ul 10 mmol/L CaCl₂。将每个反应等分为两份（a 和 b）。隔一定的时间间隔（如 15 s），在 a 管中加入 5 ul 步骤 8 准备好的 1：1500 稀释液，在 b 管中加入 5 ul 1：500 稀释液。室温消化 10 min。

11. 制备终止液（ST）：将 55 ul 0.5 mol/L EDTA 与 11 ul 10 mg/ml 的 RNase A 溶液 混合。每管中加入 6 ul ST 并涡旋混匀终止微球菌核酸酶的消化。室温放置 5 min 以消化污染的 RNA。

12. 制备蛋白酶溶液（PR）：将 1.1 ml 糖原终止缓冲液与 55 ul 2.5 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液混合。每管中加入 105 ul PR，涡旋混匀。37℃ 温育 ≥ 30 min，以消化组蛋白及可溶性蛋白。使用 200 ul 50：49：1 酚/氯仿/异戊醇抽提。上层水相加入 25 ul 2.5 mol/L 乙酸铵，475 ul 100％ 乙醇沉淀 DNA。

13. 进行琼脂糖凝胶电泳。