用S－190抽提物进行染色质重组实验

1. 实验前准备

1.1 材料

S-190 抽提物

核心组蛋白

1.2 试剂

缓冲液 R

ATP 混合物

0.1mol/L MgCl₂

DNA模板（2.5～25 kb 环状或线性化质粒，或 λDNA）

0.1mol/L CaCl₂

200 U/ml 微球菌核酸酶储液

0～5 mol/L EDTA

10 mg/ml Rnase A

糖原终止缓冲液

2.5 mg/ml 蛋白酶 K

50：49：1（V/V/V）酚/氯仿/异戊醇，用 10 mmol/L Tris· Cl， pH 8.0 平衡

2.5 mol/L 乙酸铵

70％ 和 100％ 乙醇

1.2％（m/V）琼脂糖凝胶

TBE 缓冲液

123 bp DNA 梯度（Life Technologies）

1.3 仪器耗材

27℃ 和 37℃ 水浴步骤

2. 混合 40 ul 缓冲液R、190 抽提物及核心组蛋白。室温孵育 30 min。

3. 加入 10 ul ATP 混合物，0.1 mol/L MgCl₂ 至终浓度为 7 mmol/L， 500 ng DNA 模板。27℃ 水浴 5 h。如有需要，用缓冲液 R 补齐至100 ul。

4. 加入 3 ul 0.11 mol/L CaCl₂ 至组装反应体系中。将反应液等分为两份（a 和 b）。用缓冲液R按 1：50 和 1：150 稀释微球菌核酸酶（200 U/ml）。

5. 隔一定的时间间隔（如 15 s ），在 a 管中加入 5 ul 1：150稀释液，在 b 管中加入 1 ： 50 稀释液。室温消化 10 min。

6. 加入 7 ul 0.5 mol/L EDTA 终止反应的进行。加入 1 ul 10 mg/ml 的 RNase A 溶液， 室温孵育 10 min。

7. 每个反应中加入 95 ul 糖原终止缓冲液，5 ul 2.5 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液。37℃ 温育 30 min。

8. 使用 200 ul 50:49:1 酚/氯仿/异戊醇抽提。取出 150 上层水相加入15 ul 2.5 mol/ L 乙酸铵、450 ul 100％ 乙醇沉淀 DNA。室温以最大转速离心 15 min，用 200 ul 70％ 乙醇洗涤沉淀。室温以最大转速离心 5 min，在空气中干燥 5 min。

9. 用 6 ul 凝胶上样缓冲液重悬沉淀，在 1×TBE，电压约 5～10 V/cm 进行 1.2％ 琼脂糖凝胶电泳。使用 123 bp DNA梯度作为分子质量指标。用溴化乙锭染色。