人EC和ES细胞神经分化技术

一、培 养 基 和 试 剂 的 准 备

1.培养基

IDMEM /10F B 和 D M E M /20FB

DMEM/10FB ， DMEM, 4. 5 g/L 葡萄糖，含 1 0 % 胎牛血清。

DMEM/20FB : DMEM， 4.5 g/L 葡萄糖，含 2 0 % 胎牛血清。

人 胚 胎 干 细 胞（h E S ) 培 养 基（约 500m l)

Knockout DMEM 400 ml

Knockout 血清替代品 100 ml

FGF-2 4ng/ml

非必需氨基酸， IOOX 5 ml

β-巯基乙醇 3.5ul

L-谷氨酰胺 I .Ommol/L

神 经 球 增 殖 培 养 基（100m l )

DMEM/F12 99 ml

N2 补充物 I ml

FGF-2 20 ng/ml

胰岛素 20 ug / m l

肝素硫酸钠盐 2ug/ml

神 经 球 培 养 基（100m l )

DMEM/F 12 97 ml

B2 7 补充物 2 ml

胰岛素-转铁蛋白-砸补充物 Iml

FGF-2 20ng/ml

E C 细 胞 分 化 培 养 基

DMEM/F12(见 3.4.1.1 节），补充 10mmol/L 全反式视黄酸（ATRA)。

全反式视黄酸是光敏感性的。应在暗光下操作。溶 于 DMSO, 10 mmol/L 贮存液存放于-20°C , 临 用 前 1 : 1000 稀释。

E B 培 养 基（约 500 m l )

Knockout DMEM

Knockout 血清替代品

非必需氨基酸， 100X

β-巯基乙醇

L-谷氨酰胺

2.酶

胶 原 酶

胶原酶 I V ， 10m g ， 溶 于 10m l D M E M /F 1 2 , 终浓度为 l m g /m l ， 过滤除菌。

中 性 蛋 白 酶

用无 Ca2+ 、 Mg2+ 磷酸盐缓冲液（PBSA) , 按 1:4000 稀释中性蛋白酶贮存液。

胰蛋白酶/E D T A

胰蛋白酶， 0.05% (W /V)， ED TA， 0.5 mmol/L, 溶于 PBSA。

3.基质

琼 脂 糖

琼脂糖， 1% (W /V), 溶于 D M E M /F 12 (见 3.4.1.1 节）。

明胶层

明胶， 0. 1 % (W /V ) , 溶于 P B S A 。

将明胶溶液加入到培养瓶或培养皿中，放 置 5〜10 min，除去，使培养瓶/m 干燥。

4.其他试剂

流 式 细 胞 计 数 冲 洗 缓 冲 液

(a) 胎牛血清， U .S.原产，用 P B S A 配 制 成 5 % 。

(b) 胎牛血清，U.S. 原产，用 PBSA 和 0.1% (VVV) TritonX-100 配制成 5%。

多聚曱醛， 4% (W/v)

4 g 多聚甲醛溶于 iooml PBSA，搅拌并加热直至完全溶解； 4℃存放。

Triton 溶液

用 PBSA 配制 成 0.1% ( V A O T r i t o n X -1 0 0 和 5% 胎牛血清。

含 山 羊 血 清 的 Triton X-100 缓 冲 液

P B S A 中含有 1 % (v/v) T r i t on X-100， l m o l / L 甘氨酸， 5 % 正常山羊血清。

阻 断 溶 液

PBSA 中含 5 % FBS， 0.1 % ( V / V ) T r i t o n X - 100。

二、细 胞 培 养

三、冻 存

1.NTERA2

N T E R A 2 细 胞 的 冻 存 与 复 苏

试剂和材料

灭菌

□ DMEM/10FB (见 3. 4. I.1 节）

□ 冻 存 液 ： 9 0 % FB S, 1 0 % DMSO (V /V )

□玻 璃 珠 ， 3 mm

步骤

(a) 用玻璃珠机械分散细胞培养物，并 用 DMEM/10F B 重 悬 细 胞（ 见方案 3.1)。

(b) 将悬浮细胞放人一个灭菌管中， 4°C ， 12000r/min (277 g ) 离 心 3 min。

(c) 吸出培养液，用冻存液重悬细胞团。

(d) 将细胞悬液等分到 Im l 冻存管中。

(e) 将冻存管放置到一个 Nalgene 冷冻盒中，并于一 8(TC 放置至少 24 h。

(f) 当冻存管达到-8 0 °C 时，转移至液氮储存。

(g) 从液氮中取出冻存物， 37°C 迅速融解。

(h) 用 10 mlDMEM/10FB 洗涤细胞，以去除残留的 DMSO， 1200r/min (277 g) ,离 心 3 min

(i) 用 5m l 新鲜培养液重悬细胞，接 种 到 25 cm2 培养瓶中。

人 E S 细胞的冻存与复苏

采用普通方法从 25 cm2 培 养 瓶 中 收 获 汇 合 的 细 胞（ 见 第 2 章）。并 且 用 IOml 培养液将细胞转移至 15m l 管中，然后 ，依 照 N TERA2 细胞冻存步骤进行，只是离心条件改 为 4°C ， 800r/min (123 g ) 离 心 3 min。融解温度相同。详细资料见第 2 章 的 人 E S 细胞的冻存与融解。

四、分 化

ES 细胞

视 黄 酸 诱 导 的 人 E c 细 胞 分 化

试剂和材料

消毒或无菌制备

□ NTERA2 细胞汇合培养物

□ DMEM/IOFB

□A T R A , 10mmol/L 溶于 DMSO; —20℃贮存

□分化培养液： DMEM/10F B , 添加 10 mmol/L ATRA (见 3. 4. 1. 5 节）

□胰蛋白酶/EDTA (见 3. 4. 2. 3 节）

□ 培 养 瓶 ， 75c m 2

步骤

(a) 用 2m l 胰蛋白酶-E D T A 消 化 液 于 3 7 ° C 孵 育 ，直至细胞从培养瓶底面分散下来。

(b ) 另 加 8m l D M E M /10F B , 以灭活胰蛋白酶活性。

(c) 1200r/min (277 g ) 离心 3m i n 。

(d ) 用分化培养液按每 75c m 2 培养瓶接种细胞 I X l O ⁶ 个 。

(e) 每 7 天更换分化培养液。

细 胞 在 2〜3 天内开始分化， 7 天后细胞呈现出十分特殊的形态学改变和表面抗原的表现型；第 2 周之内开始出现神经元。

ES 细胞

胚 胎 样 体（E B s ) 内 的 人 E S 细 胞 分 化

试剂和材料

灭菌

□ DMEM/10FB
□ E B 培养液：无 F G F -2 的 人 E S 细 胞 培 养 液（见 3. 4. 1. 6 节）

□胶原酶IV溶液， l m g / m l (见节 3. 4. 2. 1)

□ 玻 璃 珠 ， 3m m

□ 培 养 皿 ，细菌学级， I O c m (78.5 cm2)

□ 离 心 管 ， 15 ml

□ 涂 有 明 胶 的 培 养 瓶 或 皿（见 3. 4. 3. 2 节）

步骤

(a) 25 cmz 组织培养瓶中汇合生长的人 E S 细胞。

(b) 从培养瓶中吸去培养液，加 入 I m l 胶 原酶，确保胶原酶覆盖全部细胞的生长面 ，然后移人 37°C ， 5 %CO2) 2 温箱，作用 15min。

(C) 从温箱中取出培养瓶，检查确定细胞集落边缘卷缩，然后加人大约 2 0 粒玻璃珠到培养瓶内。

(d) 从一边到另一边轻轻摇动培养瓶，使细胞从瓶壁脱落下来。

(e) 加 人 9m l D M E M /10F B , 并 研 磨 5〜1 0 次重悬细胞。

(f) 从培养瓶中吸出细胞悬液，置 入 15m l 无菌管中。

(g ) 4°C ， 800r/min (123 片）离心 3m i n 。

(h ) IOml E B 培养液重悬细胞团块，将悬液移入一个 3. 5c m 细菌培养皿中。该步骤是有必要的，采用细菌培养皿可防止 E B 细胞附着在平皿的底部。

(i) 将平皿放置于 37°C , 5 % CO2 温箱中。

(j) 继续培养悬浮细胞，每 2 天更换新鲜 E B 培养液。

i) 将细胞和培养液转移至 15m l 管内。

ii) 使 E B s 自然沉降 l0 m in 。

iii) 吸去上层培养液，用 I O m l 新鲜培养液重悬细胞。

iv) 然后将 E B s 转人平皿内。

(k) 2 1 天悬浮培养之后，此时 E B s 应充分分化。 2 1 天之前便可见到自发分化，但人 EBs 细胞也许更早就已经存在。对于贴附和 EBs 最初分化细胞生长来说，明胶是一种有效的基质。

i) 如更换培养液一样，将 E B s 从平皿中移出。

ii) 用 E B 培养液将 E B s 细胞重新接种到覆盖有明胶的培养瓶/皿中。接种密度依据 E B s 大 小（不同的正常培养范围），但是通常情况下每 25 cm2 约 有 50个 E B s 已足够。

iii) 自发分化可见于 E B s 接种后重新贴附的生长细胞。

神经球

方 案 3. 5 来 源 于 人 E S 细 胞 的 神 经 球 的 诱 导
(按 Zhang et al. [2001])

试剂和材料

灭菌

□ DMEM/10FB (见 3. 4. I.1 节）

□ E B 培 养 液（见 3. 4. 1. 6 节）

□神经球膨胀培养液（见 3. 4. 1. 3 节）

□胶原酶 W 溶 液（见 3. 4. 2. 1 节）

□中性蛋白酶， 0. lmg/ml (见 3. 4. 2. 2 节)

□玻璃珠， 3 mm

□培养瓶， 25 cm2

□培养瓶， 25 cm2，明胶包被（见 3. 4. 3. 2 节)

□离心管， 15 ml

(C) 将培养瓶放置于 37°C， 5 % CO2 温 箱 15 min。

(d) 从温箱中取出培养瓶，检查确定细胞集落边缘卷缩。

(e) 将 约 2 0 个灭菌玻璃珠加入到瓶内，然后从一边到另一边轻轻晃动，使细胞从瓶底表面脱落。

(f) 在瓶中加 9 mlDMEM/10F B 培养液，反复晃动 5〜1 0 次 ，重悬细胞。

(g) 从 瓶 中 吸 出 细 胞 悬 液 ，加 人 到 15m l 灭 菌 管 中 ， 4°C , 800r/min (123 g ) 离心 3niin

(h) 吸去上清，加 5 ml E B 培养液，重悬细胞团块。

(i) 将悬液转移至无明胶覆盖的 25 cm2 培养瓶中，于 37°C ， 5 % CO2 温箱中孵育 4 天。

(j ) 每日更换培养液，就是将漂浮的细胞团块和培养液移至到一只 15m l 灭菌管中。

(k) 使 细 胞 团 块（EBS) 自然沉降 15 min。

(l) 吸去旧培养液，添加新鲜培养液。

(m) 重新将细胞悬液移至细胞培养瓶内，并置于温箱。

2 期（4 天）

(a) 悬浮培养 4 天之后，将胚胎样体移至 15m l 管内，自然沉降 15 min。

(b) 吸去旧培养液，加 5m l 神经球扩增培养液。

(c) 在每个明胶覆盖的 25 cm2 培养瓶中接种约 5 0 个 EBs, 并且使每瓶的神经球扩增培养液总体积达 l0ml。

(d) 将培养瓶放置于 37°C , 5 % CO2 温箱中孵育 4 天。

(e) 每 2 天换液，即吸去旧培养液，加 入 IOml 新鲜的神经球扩增培养液。

3 期（U 天）

(a) 2 期 的 1 0 天之后，相差显微镜下检查每瓶中出现的神经元玫瑰花球（图 3.1： )。

琼脂糖包被

(a) 琼脂糖包被是一种节省成本的，有效防止细胞培养瓶内的悬浮培养物产生不必要 贴 附 的 方 法（比较别的方法）。细胞孵育过程中，用 D M E M /F 1 2 制 备 1 % (W /V )的琼脂糖，并于微波炉以最大功率加热 3 〇 〜40s 直至溶解。

(b ) 室温冷却不超过 IOrnin ，然后用琼脂糖涂布细胞培养瓶的底面。很重要的一点是 ：琼脂糖足够热而没有开始凝固，如果太热，就导致培养瓶的塑料发生卷曲。

(c) 室温静置 20〜30m i n 。

(d ) 在每个有琼脂糖涂层的培养瓶中加 5m i 含有神经元玫瑰花结的神经球培养液。

(e) 放 置 到 37°C ， 5 % C O 2 温箱中。

神 经 球 培 养 物 的 维 持

试剂和材料

灭菌

□ 神 经 球 扩 增 培 养 液（见 3. 4. 1. 3 节）

□ 25 cm2, 琼脂糖包被的培养瓶，（ 见方 案 3.5 , 琼脂糖包被)

□ 离 心 管 ， 15 ml

步骤

饲养

(a) 每 3〜5 天更换一次新鲜的神经球培养液（ 依据神经球的大小）：

i) 将神经球悬浮物转移至 15m l 管内 ，使球体自然沉降 10〜20 min。

ii) 吸去旧培养液，加 人 IOml 新鲜的神经球培养液。

iii）将神经球培养物移回到有琼脂糖涂层的培养瓶中，然后将瓶放回到 37℃，5 % CO2 温箱中。

(b) 时间过长，神经球将会聚集成一个大团块，导致接种和传代困难。因此，当培养或传代时，在搅拌台上彻底分散任何细胞团块是很必要的。

神经球培养物的传代

神经球的传代每 2〜3 周进行一次，或当它们的大小一定时就进行传代。培养时间过 长 ，它们趋向聚集，并且在同一培养瓶内不要有太多的球体是很重要的。

i) 从培养瓶中取出球体，让其自然沉降，如同常规培养一样，用 10 m l 新鲜神经球培养液取代旧培养液。

ii) 为每一个要进行传代的培养瓶准备 2 个新的琼脂糖覆盖的培养瓶。

iii）用新鲜培养液将一只离心管中的神经球转移到 2 个 25 cm2 培养瓶中，并补足培养液至总体积 10 ml。

iv) 37°C , 5 % CO2 温箱孵育

神 经 球 分 化 的 再 接 种

试剂和材料

灭菌

□神经球培养物或琼脂糖包被的培养瓶

□ 神 经 球 培 养 液（见 3. 4. 1. 4 节）

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0.05% (W /V )，0.5m m o l / L E D T A

□ 明 胶 包 被 的 25c m 2 培 养 瓶（见 3. 4. 3. 2 节）

步骤

再 接 种（replating)

(a) 根据神经球的大小和要接种容器的大小，从 琼 脂 糖 包 被 的 25 cm2 培养瓶中取出所需数量的神经球。例如，直 径 约 I m m 的 2 0 个神经球适合于一个 25c m 2 培养瓶。

(b) 明胶包被的 25c m 2 培养瓶接种神经球，并使之贴附和生长 3〜4 天 ，每隔一天更换新鲜的神经球培养液。此时 ，当从球中分散出单个细胞，再定驻下来，开始增殖，便可观察到明显的神经元分化，并表现出一系列的形态学改变（图 3 . 2 ; 彩 图 1)。

再接种的神经球传代

(a) 3〜4 天后，当神经突起生长过快并盖过了瓶底区域，吸出培养液，加 }1111 胰蛋白酶/E D T A 作 用 5 min。

(b) 5 min 之后，可见大部分细胞漂浮于上清中。再 加 入 gmiDMEM/lOFB, 晃动上清数次，使得细胞从瓶底脱落下来，并进一步分散细胞的小团块。

(c) 将悬液移至 15m l 管内， 4°C , 800r/min (123 g 〇 离心 3m i n 。

(d) 去掉上清，加 9m l 神经球培养液重悬细胞团。

(e) 取 3m l 细胞悬液加入到 3 个 明胶包被的培养瓶中（ 1 : 3) , 然后在每瓶中补加培养液至总体积 10 ml。

(f) 将培养瓶放置 37°C , 5 % CO2 温箱孵育。

(g) 传了 3 代左右，神经球的残留物还将存在于培养瓶中。这可通过连续传代逐步消除，直至长成单层细胞。

再 接 种 神 经 球（N S 细胞）的维持

几次传代之后，神 经 球（ NS) 来源的细胞在培养液中显示出优势。尽管按它们的形态还不能就认定是神经元，但它们具有了早期神经细胞的饿形态标志， 如 musashi-1和 nestin (见图 3. 2)。

(a) 每隔一 天 ，吸出旧培养液，加 10 ml 新鲜培养液。

(b) 每 3〜4 天 ，用 0 . 0 5 % 胰 蛋 白 酶 和 0. 5 mmol/L E D T A 消 化 液 作 用 5 min，消化传 代 ，这与神经球再接种的方法相同。对 于 N S 细 胞 ， 1 : 3 比例分瓶即可。

五、分 析

1.间接免疫荧光

细 胞 内 抗 原

细 胞 内 抗 原 的 抗 体 染 色

试剂和材料

非灭菌

□ P B S A

□ 多 聚 甲 醛（ 见 3. 4. 4. 2 节）

□ 阻 断 剂 ： (V /V ) 羊血清和 PBSA 配制的 Triton X-100 0.1% (V /V )

□阻断剂中的一抗

□阻断剂中的二抗

步骤

(a) 用 P B S A 轻轻地清洗细胞。

(b) 室温下，与 4 % 多聚甲醛混勻』放 置 20 min。

(c) P B SA 再次清洗细胞，然后与阻断剂孵育 10min。

(d) 吸去阻断剂，加人含相关一抗的阻断剂，其适当的稀释度由滴定确定。

(e) 室温孵育 I h 或过夜。

(f) 一抗孵育之后，用 P B S A 洗 细 胞 3 次。

(g) 加人含有相关二抗的阻断剂，室温孵育 1h

(h) 用 Hoechst33342 (10 Mg/ml) 染细胞核 5 min。

(i)P B S A 洗涤并保存在 P B S A 中待观察。

溴 脱 氧 尿 苷（B r d U ) 染色

鉴定和检测细胞分化途径的一个重要方面是要确定特殊的细胞类型。判断是属于有丝分裂期后的还是仍保持增殖，通过掺人胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物（BrdU) , 可以准确评价细胞是否进行增殖，即细胞是否继续进行 DNA 复制。运 用 方 案 3 . 9 , 可评价BrdU 掺人的再掺入，并同时采用蛋白表达的荧光染色法（图 3. 3 ; 彩 图 2)。 BrdU 作用时间的长度限定了如何解释结果： BrdU 短暂作用 lh ，能够使特殊表型的细胞增殖（标记指数），而作用时间较长（24 h)，可估计活跃分裂的细胞数量（生长分数）。

方 案 3. 9 分 化 神 经 元 细 胞 的 标 记 指 数 和 生 长 分 数 的 确 定

试剂和材料

灭菌

□神经球或再接种神经球生长培养物

□ PBSA

□ BrdU， l0 mmol/L , 溶于适当的生长培养液

非灭菌

□ HC1， lmol/L 和 2mol/L

□ I5B S A Triton X-100: P B S A 中含 0.1 % (V/V) 的 Triton X-100

□硼酸盐缓冲液，0.l m o l / L

□ 含 Triton X-100, 甘氨酸和正常山羊血清的 PBSA (见 3. 4. 4. 4 节）

□抗-BrdU 抗体

□ Hoechst33342 ， lOug/ml, PBS 配制

步骤

(a) 去掉生长培养基，加人含 B r d U 的培养液。

(b) 按所需时间进行孵育（标记指数实验需 lh ，生长分数实验需 24 h)。

(c) PBSA 洗涤细胞。

(d) 4% 多聚甲醛 4°C 固定细胞 30 min。

(e) 用 含 1 % Triton X-100 的 PBSA 洗涤细胞 3 次，每次 5 min。

(f) lmol/L HC1，冰上孵育细胞 lOmiti，以打开标记细胞的 DNA 结构。

(g) 室温， 2mol/LHCl 作用 10 min。

(h) 37°C 孵育 20 min。

(i) 加入硼酸盐缓冲液中和酸性物质。

(j) 室温孵育细胞 12 min。

(k) 室温下用 PBSA/Triton X-100 洗涤样品 3 次，每次 5 min。

(l) 用含TritonX-100、甘氨酸和山羊血清的PBSA孵育 30min。

(m) 4°C 下 ，用抗-B rd U 的抗体或抗-B rdU 和其他抗体的化合物孵育细胞过夜(Nestin 或 T U Jl)。

(n) P B SA /Triton X-100 洗涤细胞 3 次，每次 5 min

(o) 细胞标本可用一系列的二级抗体作用来显示抗-BrdU 标记的细胞。

(p) 含 Hoechst33342 10/xg/ml 的 PBSA 孵育细胞 5 min。

(q) PBSA 洗涤并贮存细胞，以备流式细胞仪进行分析。

流式细胞术

细 胞 表 面 抗 原

经间接免疫荧光染色的未固定的单细胞悬液可用流式细胞仪进行分析。

方 案 3. 1 0 神 经 元 细 胞 表 面 抗 原 的 流 式 细 胞 术 分 析

试剂和材料

灭菌

□胰蛋白酶/EDTA (见 3. 4. 2. 3 节）

非灭菌

□ —抗 ，二抗

□流式细胞术洗涤缓冲液（见 3. 4. 4. Ia)

□ FA CS 缓冲液

□ FACS 管

步骤

(a) Im l 胰蛋白酶/ED TA 作用细胞约 2 min, 以获得单细胞悬液。

(b) 在细胞悬液中加人 9 ml 洗涤缓冲液并轻轻晃动，直至全部小团块分散成单个细胞。

(c) 血球计数板确定细胞浓度。

(d) 4°C , 1200r/min (277 g ) 离心 3 min。

(e) 吸去上清，用流式细胞术洗涤缓冲液重悬细胞，并使细胞浓度达到 5X 10⁶个/ml。

(f) 96 孔板，每孔加 50M 1 细胞悬液。

(g) 将抗体稀释成相应的工作液体积（用流式细胞术洗涤液稀释），并且在含有细胞的孔中加人 50ul。作为阴性对照，可选择不加一抗或用亲本骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8产生的非特异性抗体替代。或许，某些人可能认为使用不与细胞结合的同类抗体是必要的。

(h) 用封口机密封平板，并将之放到摇床上 4℃摇 动 lh 。

(i) 初次孵育之后， 4°C , 1200r/min (277 g) 离心平板 3 min。

(j) 去掉封口膜，吸去含抗体的溶液，留下细胞团。

(k) 用 100ul洗涤液洗细胞，共 3 次。

(l) 稀释二抗，并在每孔中加人 50ul，然后将平板放回到摇床上， 4℃摇 动 lh 。

(m) 孵育后，离心，并洗涤细胞 3 次，然后在 FA CS 管内，用 5OO 0 FA CS 缓冲液重悬细胞。

(n) 流式细胞术分析。省略非单个细胞、前散射光的细胞碎片和倒散射光的死亡细胞。每份样品分析至少 1000 个细胞。

胞 内 抗 原

除去细胞固定和渗透的要求外，用流式细胞术检测胞内抗原如 S 〇 x2 的方法与分析细胞表面抗原的方法非常相似。

方 案 3. 1 1 用 流 式 细 胞 术 分 析 神 经 元 细 胞 的 胞 内 抗 原

试剂和材料

灭菌

□胰蛋白酶/EDTA (见 3. 4. 2. 3 节）

□ PBSA

非灭菌

□ 多 聚 甲 醛 ， 4% ( W / V ) (见 3. 4.4. 2 节）

□ 阻 断 液（见 3. 4. 4. 5 节）

□ 流 式 细 胞 术 洗 涤 液（见 3. 4. 4. I b 节）

步骤

(a ) 胰蛋白酶消化细胞，重悬 ，用 4% 多聚甲醛室温同定 20 min。

(b ) P B S A 洗涤细胞二次， 1200r/min (277 g ) 离 心 3m i n ， 收集细胞。

(C) 用阻断液充分重悬细胞，使之浓度为 5X 105 个/m l，室温孵 育 lOmin。

(d) 在 50ul细胞悬液中加人适当稀释度的抗体 5 〇 mi ，使 总 体 积 为 的 悬 液 。

(e) 4C , 放置 lh 。

(f) 细胞洗涤并二抗染色，与 方 案 3 .1 0 中（i)〜（n) 步骤完全相同。除去二抗染液中含有的 Triton X-IOO ( 0 . 1 % ， VAO 之 外（见 3. 4. 4.1b 节）。

(g) 在荧光显微镜下可见染色的细胞（图 3 . 4 ; 彩 图 3)。

荧 光 激 活 的 细 胞 分 类

基于细胞表面抗原表达（NCAM， A2B5 等），通 过 荧 光 激 活 的 细 胞 分 类（FACS)可获得纯化的细胞类型。我 们 发 现 FA C S 对于分化之前的未分化细胞的纯化，以及分化细胞群体的纯化都具有价值。一旦获得活的分类细胞，那 么 就 可 以 进 行 PC R 分析或Western 杂交，或维持活细胞留待日后的进一步分析。

方 案 3.12 神 经 元 细 胞 的 焚 光 激 活 分 类

试剂和材料

灭菌

□胰蛋白酶 / E D T A (见 3. 4. 2. 3 节）

□一级和二级抗体

□ D M E M /10F B (见 3. 4. 2. 3 节）

□ D M E M /20F B ： D M E M , 20 % F B S

□ 庆 大 霉 素 ， 50 mg/ml (IF：存液）

□ F A C S 缓 冲 液（含 10% F B S 的 P B S A )

□ F A C S 管 ， 5m l , 75X 12m m

步骤

(a) 胰蛋白酶消化细胞成单细胞悬液。

(b) 除去使用正常生长培养液稀释的抗体和洗涤细胞之外，按流式细胞术分析法(见方案 3. 1 0 ) 中描述，用一抗和二抗进行细胞染色，按比例提高细胞数量和抗体的体积。

(c) 抗体染色后，用合适的流式细胞光度计分析细胞并分类。

(d) 用 含 2 0 % 胎牛血清的补充培养液收集已分类的细胞。一且收集细胞后，就要用于分子分析或在突光显微镜下见到突光时，将细胞接种到含抗体（庆大霉素 50ug/ml) 的正 常 生 长 培 养 液 中（图 3 . 5 ; 彩 图 4)。在 FA C S 期 间 ，依 据 细 胞 类 型 使 用 培 养 液 。NTERA2 细胞可在含血清的培养液中处理，而 人 E S 细胞则在其常规生长培养液中处理。

神经元计数

E C 和 E S 细胞在高密度生长时呈现典型的分化状态，这很难用肉眼计数神经元的数量。因而，为了容易计数神经元，我们在进行免疫荧光染色之前以较低的密度接种细胞。

方 案 3. 1 3 计数培养的神经元

试剂和材料

灭菌

□ D M E M /10F B

□胰蛋白酶/EDTA (见 3. 4. 2. 3 节）

□ T U J l 抗体

□多孔培养板， 1 2 孔（3c m 2/孔）

非灭菌

□多聚甲醛， 4 % (W/V )

□ Hoechst33342 DNA 染料， 50n g / m l

步骤

(a) NTERA2 细胞经视黄酸诱导（见方 案 3. 3 ) 作 用 2 1 天之后，胰蛋白酶消化，并 用 DMEM/10F B 重悬细胞。

(b ) 以 I X l O⁵ 细胞/ c m 2 的密度将细胞接种到 1 2 孔培养板中，并孵育 48 h , 使细胞贴附并易于轴突生成。

(C) 室温下， 4 % 多聚甲醛固定细胞 20 min。

(d) T U Il 进 行 染 色（见方案 3.11)。

(e) TUJl —旦着色，用 Hoechst 33342 进行复染，计数细胞核的数量即为细胞的总量。

(f) 通过对 T U J l 的反应性识别神经元。识别神经元基于其形态学特点（胞体小,至少有一条突起）。

对于总细胞数和神经元计数，至少选择 5 个单独视野，有 500 个以上的细胞。

六、高 通 量 筛 选

由于 NTERA2 细胞易于培养，以及产生出能预知神经元百分率的可靠性，使得该细胞系成为以高通量系统研究细胞分化的理想细胞。长期以来，医药公司已经利用高通量技术筛选化合物库鉴定潜在的药物。现在，它也愈来愈适宜基础实验室使用这些自动化 技 术 [Abraham et al. ， 2004; Fennell et al. ， 2006]。

自动化系统和使用 96 孔板的优势在于容易探索多种细胞培养参数（底物黏附、基础培养基类型、培养基附加成分、生长因子等）。通过使用荧光指示剂可以完成诸如神经元分化、细胞分析等过程，还可用系统软件进行自动成像分析并记录结果。多重细胞参数能够快速量化，包括细胞计数、轴突外长、核质蛋白定位，以及细胞活性分析。

在高通量分析的使用中，多重因子会增加细胞实验的噪声和变异性。特别是，我们观察到 96 孔板边缘孔与中央孔的细胞生长的差异，这种现象称之为「边缘效应，』（edgeeffect)。据认为％ 孔板边缘效应源于板周围的过度蒸发。现已有报道介绍减低该效应的 方 法 [Lundhoketal., 2003]。若试图消除边缘效应，我们发现最好不使用边缘孔，只使用其中的 60 个 孔（6X 10)。

微量滴定分析

要测定细胞系对要测试化合物和培养基条件的耐受性，可 在 96 孔 板（胶原包被的）的每一个孔中加 1000ul 标准生长培养液并含有 3000 个细胞 。 一 旦细胞已经充分贴附(4 h 之后），将标准生长培养液更换成含化合物的培养液 （1504)。然后隔天换液。分析化合物对 NTERA2 细胞的效应，用 含 5 % 血清的培养液代替标准生长培养液(10% 血清的生长培养液）。减少血清浓度将可降低血清蛋白产生的假象。 NTERA2 细胞可长期维持在含血清 5 % 的培养液中，但是，它只能在含 2. 5 % 血清的培养液中存活大约一周。

活力分析

用细胞健康特性显示溶液对细胞进行活体染色 （见表 3 . 2 ) 并 在 20 min 内检测。每孔计数约 10 个视野的细胞数，记录总细胞数。鉴定细胞核，用拆解法进行计数，要将密集堆积的细胞拆分开，计数那些边界清晰，所属范围以内的细胞核，而不是荧光强度。

细胞毒性分析

由于培养基的成分导致细胞毒性，其测定方法是采用比色法 （Cytotox 96 非放射性细胞毒性试验， P r o m e g a ) 对 乳 酸 脱 氢 酶 （L D H ) 活性进行定量分析。细胞裂解释放出L D H 可使培养基tetrazolium 盐转化成一种红色的甲臜产物，其数值与细胞裂解的数量成比例。这可通过分析实验变量的不同类型加以证实，这是因为代谢产物分析易导致误 差 [ 如 可 参 阅 Kendig and Tarloff, 2006]，并且，这种显著的影响还必须用某种其他的细胞毒性来证实，例如，撤除实验化合物之后的 M T T 试 验 [ P l u m b etal. ， 1989] 。

在 96 孔板中接种细胞， 8000 个/孔 ，加 lOOpl 相应的测试药物或培养液， 24 h 或48 h 之后分析，按仪器说明书的步骤进行测定，并在读板仪上测定光吸收。

逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应 （RT-PCR)

采 用 R T -P C R 分析可以方便地检测多基因表达。其优势是，无论是单层或悬浮生长的细胞群体都可运用 R T -P C R 分析基因表达，前提是细胞要彻底破裂并能够成功提取R N A 。 P C R 避免了实验中出现的诸如用抗体标记大量细胞团 （E R s 或神经球）的问题。

I R N A 提 取

胰蛋白酶收获细胞， P B S A 重悬细胞。 4°C , 1200r/min (277 g 〇 离 心 3m in 之 后 ，重悬细胞团，要么立即使用该细胞，要么 -70°C 冻存 。采 用 某 种 标 准 方 法 提 取 R N A ，如使用 R N e a s y Mini Kit (Qiagen, U .K _) , 依照操作手册进行。

3.9.4.2 逆 转 录 c D N A 产 物 （表 3. 3)